纳米抗体：作为诊断和治疗性抗体的前景与挑战

前 言  

2022年4月，为了纪念其博士生导师，单域抗体之父Raymond Hamers教授，来自加拿大渥太华大学Mehdi Arbabi-Ghahroudi在期刊International Journal of Molecular Sciences上发表了题名为“Camelid Single-Domain Antibodies: Promises and Challenges as Lifesaving Treatments”的综述文章，本期小编就将该文章中一些内容进行介绍。

1.Camelid VHHs与抗原相互作用 

为了了解VHH与抗原相互作用的情况，研究者对105个VHH-抗原进行分辨率<3 Å的晶体结构分析，结果发现VHH倾向于识别更刚性、凹陷、保守和富含芳香、极性、带电和疏水氨基酸组合的结构化表位。研究还发现，VHH的CDR3区在VHH-抗原相互作用中贡献率为50%，而CDR2和CDR1区贡献率分别为20%和13%。此外，位于VHH骨架上四个不同区域non-CDR残基对VHH-抗原相互作用中贡献率为16%，这四个区域包括：第一个β链的N端区域(A)、FR2区域、C"D环以及DE环(也称为CDR4)。总之，VHH似乎在利用每一个残基来加强VHH-抗原结合的亲和力(图1)。而相比之下，在227个传统抗体-抗原复合物结构中发现，80%的相互作用限制于4-13个残基。此外，在30个对结合亲和力有重大贡献的突出位置中，有3个位于框架区域，其余27个位于CDR区域，这表明常规抗体比HCAbs更依赖通过CDR区域的氨基酸进行结合。综上所述，这些发现表明VHH抗原的相互作用不像常规抗体-抗原相互作用，而更类似于蛋白质-蛋白质相互作用，VHH中的每一个氨基酸位置对结构完整性和抗原结合都具有非常重要的意义。

图1 纳米抗体CDR和non-CDR结构

2.Camelid VHHs作为治疗药物研究进展 

1989年，Raymond Hamers及其同事在骆驼科动物中发现了HCAbs，经过几年的研究证明骆驼科动物中这些较小的抗体不是人为的，也不是疾病导致的，而是天然存在的。他们的研究结果最终于1993年发表在《自然》杂志上。随后，应用抗体工程和噬菌体展示技术，构建了Camelid重链抗体库，Camelid重链抗体片段(VHH)被确立为一个独立的抗原结合域，具有良好的生物物理化学特性。大约十年后，2001年12月，由比利时弗兰德生物技术研究院(Vlaams Instituut voor Biotechnologie-Flanders Institute of Biotechnology，VIB)分拆成立Ablynx生物制药公司，首次开始将单域抗体(VHH)作为潜在的治疗方法。

VHH发现后的第一个十年的主要科学发展包括：(a) 对cDNA文库获得的VHH序列进行了深入的研究，并确定了VHH家族；(b) 骆驼科基因组研究揭示了VHH和VH基因片段的位置，并阐明了VHH Germline；(c) 应用噬菌体展示技术从免疫文库中分离出VHHs，其中有一些被证明是酶抑制剂。(d) 一些VHH-抗原复合物的高分辨率晶体结构，揭示了VHH-抗原相互作用与传统抗体-抗原相互作用的不同；(e) 利用细菌和酵母系统表达大量的VHH，并评估各种纯化方案以获得高纯度的VHH蛋白；(f) 使用VHHs作为免疫亲和纯化试剂。

VHH发展的第二个十年(2003-2013年)，由比利时VIB和其他子公司以及全球50多个机构发表的论文和专利申请呈指数级增长。这十年的主要标志是Ablynx和其他公司开始对几种纳米抗体作为治疗性药物和医学影像试剂进行临床前和临床研究，主要包括：(a) 血管性血友病因子(vWF)；(b) 病毒性感染(RSV)；(c) 毒液毒素；(d) IL6-R治疗类风湿关节炎的临床研究；(e) 使用放射性标记的纳米抗体进行HER2+肿瘤成像。在这十年中，在异源系统中表达VHHs以及创造一系列具有卓越疗效的双价和多价VHHs方面也取得了重大的技术进步。

自2014年以来，VHH发展更加活跃。Ablynx第一个治疗性单域抗体(Caplacizumab)I期临床试验结果公布，其表现出优良的有效性和安全性，证明纳米抗体可以应用于疾病治疗中。大约在同一时间，更多基于VHH的治疗方法被推进到临床试验中，同时Ablynx加强与Merck，Boehringer Ingelheim，Sanofi等大型生物制药公司的合作，有超过20个临床前和临床研究项目在进行中。另一个发展是2014年在欧洲和2017年在美国有一项主要骆驼专利到期。Ablynx历史上的转折点发生在2018年1月，Sanofi宣布以48亿美元的价格收购这家比利时生物技术公司。在此之后，在2018年年底，第一个纳米抗体药物(caplacizumab；用于治疗罕见凝血障碍的二价抗vWF纳米抗体)获得了EMA的批准(FDA于2019年2月批准)并进入市场。Caplacizumab是FDA批准的第11个抗体片段，在此之前，一些Fabs和scFvs(基于传统mAbs)在过去20年中进入了临床(表1)。随着对VHH知识产权限制逐渐减少，生物制药和生物技术公司对研究VHH在医学(作为治疗和诊断试剂)、工业和科研领域的潜在应用的兴趣越来越大。例如，日本的大正药业使用Ablynx公司的Anti-TNF VHH，开发了一种人源化的三特异性纳米抗体药物ozoralizumab(两个Anti-TNF VHH与一个Anti-HSA VHH相连)，该治疗药物目前正在接受日本药品和医疗器械管理局(PMDA)的审查。截至2021年，超过25家公司正在直接或者间接与Ablynx(Sanofi)合作进行不同领域的VHH开发应用。

表1 FDA和EMA批准用于各种疾病适应症的抗体片段，统计截止2022年3月

3.Camelid VHHs：优点，缺点和应用 

Camelid VHHs优点之一是由于其是单链，非常适合于采用抗体展示库进行筛选。传统抗体演变而来的ScFv，需要将VH与VL人工拼接，因此会影响其稳定性和正确折叠，同时由于VH与VL是人为拼接，失去天然VH-VL配对，需要更大的文库才能筛选出正确的组合。第二个优点是VHHs分子量小，可以快速外渗、深入肿瘤组织，同时快速被组织和血液清除，因此可以应用于癌症治疗(作为免疫毒素或放射性同位素结合物)和肿瘤成像中。其中一个例子是研究人员开发了一种与68Ga-NOTA共轭的放射性标记的Anti-HER2 VHH，利用PET/CT检测乳腺癌患者的脑转移，目前正在进行二期临床试验(NCT03331601)。

VHHs的其他特点包括高热稳定性（高重折叠能力）和对恶劣环境的相对抵抗力，如胃肠道和化学变性、非生理性pH值和高压。这些特点使VHHs成为口服和雾化治疗、抗体-药物偶联和固定在微芯片生物传感器上的理想试剂。此外，VHHs由于其单体性质，非常适合应用于双特异抗体，多特异抗体以及CAR-T中，一些双/多价特异治疗性纳米抗体已经由Ablynx/Sanofi和其他生物制药公司推进到临床前和临床开发，第一个基于VHH的CAR-T(ciltacabtagene)，其结合域中有两个抗BCMA的VHH，于2022年3月被FDA批准用于治疗难治性多发性骨髓瘤。

当然，VHHs本身也具有一些缺陷，比如其作为治疗性药物时，由于其体积小，半衰期短，因此肾脏清除快，有几种方法可以延长其半衰期，包括：二聚体/多聚体化，PEG化，与人血清白蛋白融合，或与第二个抗血清白蛋白结合的VHH融合。此外，与ScFv相比较，VHH的每一个氨基酸残基都非常重要，导致在VHH人源化时，只能进行有限的突变，完全人源化常常会导致亲和力急剧下降，稳定性变差以及表达量降低。

结 语  

Raymond Hamers教授及其同事在比利时发现骆驼重链抗体近三十年后，已经发表了无数的研究文章和专利，其发现的商业成果正逐步进入医药市场。值得一提的是，Raymond Hamers教授及其同事在首次观察到HCAbs后，当时的情况是相当黯淡的，经过几年的深入研究，才证明这些抗体是天然产生的，而不是疾病的副产物。随后，cDNA测序以及基因组和结构数据的积累，研究人员才拼凑出大自然所设计的一幅美丽的图画，现在被称为“VHHs”或 “sdAbs”或“nanobadies”。目前，全球有越来越多的科研团队和商业团队正在积极地独立或合作研究VHHs。 与经典的mAbs类似，VHHs正在被开发用于传染病(SARS-CoV-2)、癌症(双特异性抗体和CAR-T)、中枢神经系统疾病(BBB药物输送)等领域之中。尽管早期有一些挑战和挫折，但是随着第一个基于VHH的治疗药物(caplacizumab)和另外16个基于VHH的药物在不同的临床开发阶段获得批准，似乎VHH正在逐渐找到其在生物药市场的定位。据预测，在未来十年内，将有更多基于VHH的治疗和诊断试剂进入市场，希望其价格更低，并具有比传统mAbs及其片段更优越或至少是互补的药物功能活性。

文献来源：

Arbabi-Ghahroudi M. Camelid Single-Domain Antibodies: Promises and Challenges as Lifesaving Treatments[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(9): 5009.