世界渐冻人日| 多国科学家研究间充质干细胞治疗渐冻症，取得进展

自从1997年起，每年的6月21日就是“渐冻人”协会国际联盟选定的“世界渐冻人日”。每年这个时候都会举行活动，帮助社会公众认识运动神经系统相关疾病，旨在引起民众对这种疾病的认识与关注。

渐冻症的学名叫肌萎缩侧索硬化症（ALS），是一种致死性神经退行性疾病，其特征是上运动神经元（UMN）和下运动神经元（LMN）选择性变性，导致运动和运动外症状。患者可先表现为脊椎病，这是最常见的以四肢肌肉无力为特征的形式，也可表现为以构音障碍和吞咽困难为特征的疾病。

通常，肌萎缩侧索硬化症会在3-5年内导致死亡，剩余的生命常常是以“天”来计算。呼吸衰竭被认为是肌萎缩侧索硬化症的主要并发症之一，也是导致死亡的主要原因之一。在欧洲，肌萎缩侧索硬化症的发病率估计为每10万人2-3例。

渐冻症的病因尚不清楚，主要涉及的突变基因是SOD1，TARDBP，FUS，OPTN、VCP、UBQLN2、C9ORF72和PFN1。大约三分之二的家族性病例涉及这几个基因（C9ORF72、SOD1、TARDBP和FUS）突变引起。渐冻症的疾病病理包括兴奋毒性、神经炎症、线粒体功能障碍和蛋白质错误折叠。此外，环境和生活方式也是影响渐冻症发病的因素，如饮食因素、农药或重金属暴露、吸烟、酒精、病毒感染等真菌感染、缺乏体育锻炼和电磁辐射辐射。 

目前，能够明显阻止渐冻症疾病发展的治疗药物，还没有被开发出来。现在只有两种药由美国FDA批准ALS治疗：利鲁唑（Riluzole）和依达拉奉（edaravone）。利鲁唑是一种谷氨酸拮抗剂，能够延长存活时间渐冻症患者。依达拉奉最近获得批准作为抗氧化剂，能减少氧化损伤的作用运动神经元和胶质细胞的应激。

MSC治疗ALS动物模型的研究

给SOD1-G93A辐射小鼠静脉注射MSC后，MSC在小鼠体内存活20周以上，并向脑实质和脊髓内迁移；经MSC治疗后，渐冻症模型小鼠表现出明显的延迟发病和延长寿命。然而，只有一个少量MSC迁移到动物的中枢神经系统，表明它们的作用不明显依赖于长期植入。MSC保护受伤的神经元和减少神经元的凋亡，很可能是通过GDNF或bFGF来发挥作用的。 

给SOD1-G93A老鼠腰脊髓注射人骨髓MSC，防止星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化，减少炎症，从而延缓渐冻症相关运动神经元数量的减少，从而改善运动能力。也有研究发现单次注射MSC的效果不明显，但是多次脑脊液注射MSC则可以增强运动能力，运动神经元减少，和提高SOD1-G93A小鼠存活率。渐冻人骨髓MSC治疗SOD1-G93A小鼠的疗效呈剂量依赖性，1x10^6MSC就能延长存活时间和延缓运动功能的下降。

SOD1大鼠的脊髓运动神经元周围存在异常紊乱的腹角周围神经网（PNN）结构，显示出一些CSPG的蛋白和基因表达谱不同；经过MSC治疗后保留了PNN结构，并改变了CSPG的表达，表明CNS可塑性重新激活，与运动神经元的更好存活相关。

MSC治疗渐冻症的临床研究

由于在ALS啮齿动物模型中取得了可喜的结果，不同的临床试验评估了MSC在渐冻症患者中应用的安全性和疗效。为了评估疾病进展，修订的ALS功能评定量表（ALSFRS-R）可以衡量临床效果疾病的严重程度，是最常用的临床量表临床试验。 

因为绝大部分临床研究采用鞘内注射的方式，因此需要评估鞘内注射MSC伴随而来的安全性。在脂肪MSC剂量递增（从1×10^7个细胞到2次1×10^8个细胞）鞘内注射的临床研究中，最常见的不良事件是与最高剂量相关的暂时性下腰痛和腿痛。在记录最多的不良事件中，他们报告了头痛、发烧、呕吐，腿部、肋间和背部疼痛以及颈部僵硬，还有腿部感觉障碍，大多数不良反应是轻微的和可逆的。

总的来说，静脉注射和鞘内注射MSC均有较好的安全性，患者耐受性很好，随访期内没有记录到严重的不良反应，未见肿瘤形成。 

全球第一例MSC治疗渐冻症的临床报道是在2003年，意大利都灵大学神经内科团队开展的自体骨髓MSC腰穿局部注射治疗7例渐冻人，患者肌力在治疗前的6个月内全部下降，MSC治疗后第三个月4例患者肌力线性下降趋势明显减慢，2例轻度肌肉萎缩在治疗后出现肌肉力量的增加；无患者出现呼吸衰竭、死亡等重大不良事件，轻微不良反应为肋间疼痛放疗（4例），术后平均3天可恢复；腿部感觉障碍（5例），术后平均6周可恢复。

随后该团队继续开展自体骨髓MSC鞘内注射治疗渐冻症的临床研究，在随访的36个月，4例患者的FVC和ALSFRS评分线性下降明显减慢。该团队汇总之前的临床研究，开展的1期临床研究（10名渐冻症患者），MSC鞘内注射的安全性较好，但是单次治疗的效果并不如意。继续观察MSC治疗渐冻症的效果，最长将近9年的随访时间，进一步肯定了长期安全性，但是也发现单次鞘内MSC治疗渐冻症的长期效果欠佳。疗效很可能与该团队培养MSC的质量不佳有关，好多MSC鉴定细胞表型的指标不达标（见下图）。

以色列研究团队开展自体骨髓MSC治疗渐冻症的临床研究，19例患者接受MSC鞘内注射，9名患者同时接受1次静脉注射，前6个月的观察中ALSFRS平均分数保持稳定，在MSC治疗后Treg细胞的数量短期内有所增加。

该团队继续开展1和2期临床研究，其中1/2期有12名患者和2a期有14名患者（20-75岁），经过肌肉注射联合鞘内注射MSC，大部分患者自我感觉改善良好，根据肺活量（FVC）和ALSFRS-R评分，这些患者治疗后6个月在疾病进展恶化速率方面至少有25%的改善。

以色列和德国联合开展自体骨髓MSC（1x106/kg）治疗渐冻症的临床研究，共纳入48名患者，在1年的随访中，与对照组的9.7%相比，鞘内注射MSC组和静脉注射MSC组分别有58.6%和40.6%的患者没有出现疾病的进展恶化。 

韩国的团队开展MSC治疗渐冻人的临床研究，7名渐冻症患者进行2次的鞘内注射自体骨髓MSC（1x10^6/kg），能减轻炎症水平，明显减缓渐冻症功能评定量表分数的下降幅度。随后该团队开展2期随机对照临床研究，64名渐冻症患者随机分组为单纯利鲁唑治疗组和利鲁唑联合MSC治疗组，利鲁唑联合MSC治疗组患者的ALSFRS-R评分的改善比较明显，但是奇怪的是，两组患者的长期生存率没有差异。该团队发现MSC高表达VEGF、ANG和TGF-β，则MSC治疗渐冻症容易出现病情改善（有应答），因此VEGF、ANG和TGF-β的表达水平可作为预测自体骨髓MSC治疗效果的潜在生物标志物。 

美国梅奥诊所开展27例自体脂肪MSC治疗渐冻症的临床研究，5种不同的剂量鞘内注射MSC，最常见的不良反应是暂时性腰背痛和神经根痛，临床MRI显示腰骶神经根增厚与CSF蛋白和有核细胞升高有关，但是ALSFRS-R评分显示在所有接受治疗的患者都出现疾病的持续进展。

梅奥诊所的该团队研究人脂肪MSC在人工脑脊液中培养后的形态、代谢和基因表达的变化，发现MSC在人工脑脊液中培养后表达更高的营养生长因子；鞘内注射自体脂肪MSC治疗后，患者脑脊液中生长因子（VEGF、PIGF、GDF-15）的含量呈剂量依赖性增加。不过，从该团队养的脂肪MSC的照片来看，MSC的胞体失去了典型的成纤维细胞样的梭形，胞体变得扁平宽大，说明MSC出现衰老和增殖缓慢（见下图）。

捷克科学院团队开展了一项前瞻性、非随机、开放性临床试验（I/IIa期），以评估自体吐穗MSC治疗ALS的安全性和有效性；总共有26名患者接受了(15± 4.5)×106个MSC经腰椎穿刺进入脑脊液，约30%的患者出现轻度至中度头痛，ALSFRS评分在MSC治疗后3个月下降持续6个月（p<0.05），FVC值在9个月内保持稳定或高于70%。

波兰某研究团队开展脐带MSC鞘内注射治疗渐冻症的临床研究，重点评价安全性，结果发现只有1例患者出现头痛的症状。随后该团队根据ALSFRS-R评分的月平均变化，对8名渐冻症患者进行自体骨髓MSC治疗（3次）的数据进行分析，结果发现在进展缓慢的渐冻症患者中，疾病进展率没有明显变化，但是对于病情进展较快的渐冻症患者，MSC治疗后病情会出现减慢。

该团队开展异体脐带MSC治疗渐冻症的67例对照临床研究，所有患者接受三次脐带MSC鞘内注射（每2个月一次），剂量为30×10^6个细胞。采用ALSFRS-R量表对患者进行评估，治疗组的中位生存时间增加了两倍，49.3%的患者出现疾病无进展，31.3%的患者进展率下降，19.4%的患者没有应答效果。 

综上所述，开展MSC治疗渐冻症的国家就有意大利、以色列、韩国、美国、捷克、波兰。 

ALS患者是否合适自体MSC治疗？

骨髓MSC治疗的一个优点是有可能进行自体移植，因此，有必要评估来自ALS患者的MSC是否可用于自体治疗，是否能够发挥和来自健康捐赠者MSC的相同效果？ 

从ALS患者分离的自体骨髓MSC，与从健康捐赠者分离的骨髓MSC进行了比较，结果表明从患者或捐赠者分离的MSC在形态、分化潜能、染色体改变和免疫表型分析、免疫调节方面没有差异。但是渐冻症患者的骨髓MSC更容易向脂肪分化，而且分泌HGF的水平远低于健康人骨髓MSC。

 韩国汉阳大学医学院团队发现渐冻症患者的骨髓MSC表达很低的干性基因（Oct-4和Nanog）和生长因子（ANG、FGF-2、HGF、IGF-1、PIGF和VEGF），同时伴随着迁移趋化能力的下降。正式因为渐冻人自体骨髓MSC的干性丢失和大量生长因子分泌减少，所以该团队建议采用异体健康的MSC用来治疗渐冻症。

对自体骨髓MSC治疗渐冻症的文献进行meta亚组分析显示，鞘内注射的MSC治疗后6个月和1年的疗效均优于静脉注射，差异有统计学意义（p<0.05）。

如果非得用渐冻人自体骨髓MSC来治疗渐冻症，那么建议用培养细胞代数较前的MSC（比如4代之前），因为随着培养时间延长，患者自体骨髓MSC会出现明显的衰老和分泌生长因子的减少。 

小结

动物实验和临床研究证明，MSC可能是治疗ALS的一种安全有效的方法，能延缓了疾病的发生和发展，并延长了治疗动物的寿命。 但是，目前的临床研究方案只涉及1-2次的MSC治疗，所以在一定程度上导致MSC治疗ALS的临床评分只有部分改善。既然动物实验有效，临床治疗部分患者也有效，那么接下来就是研究如何做到更有效。为了获得更显著的结果和更好地了解潜在的MSC的作用机制，有必要进行治疗方案的优化和提高MSC的培养质量。