体内 CAR-T 细胞疗法走向临床,还面临哪些障碍?

2022
06/24

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嵌合抗原受体 T 细胞(CAR-T)疗法是一种特殊的癌症免疫疗法:它拥有前所未有的疗效,但研发过程复杂且成本高企。

编译丨Aspen

来源丨金斯瑞

嵌合抗原受体 T 细胞(CAR-T)疗法是一种特殊的癌症免疫疗法:它拥有前所未有的疗效,但研发过程复杂且成本高企。到目前为止,该疗法还不是一个能让所有患者都受益的治疗选择。这促使全世界科研人员共同努力来改进 CAR-T 疗法。

在所有已提出的改进方案中,直接在患者体内生成 CAR-T 细胞可以说是最具挑战性、也最具临床价值的策略。这可以使 CAR 疗法从一种基于细胞的自体药物产品转化成为一种具有普适性的现货疗法。

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近日,Molecular Therapy 期刊发表了一篇综述论文,介绍了目前最前沿的体内 CAR 治疗方案,上一期,我们解读了这些疗法中所使用的载体技术点击查看)。

今天,我们继续介绍不同载体平台的特性,例如它们的免疫原性、效力和CAR递送模式等等。最后,作者还概述了将体内 CAR 治疗从概念验证推进到临床应用所需做的工作

在用于小鼠 T 细胞 CD3 靶向的纳米载体 (NC) 和用于人类 T 细胞的 CD8-慢病毒的研究之后,又有多项研究进一步利用各种载体平台在临床前小鼠模型中探索体内 CAR 生成策略。已报道研究中的模型系统、应用路线、载体剂量、细胞靶标、时间点和读数的异质性阻碍了平台之间的直接定量比较。尽管如此,这些研究还是揭示了载体平台之间重要的本质化差异,这些差异可能会深刻影响各平台技术未来的发展轨迹。

靶向及生物分布

除了一篇使用 AAV 载体的报道外,几乎所有关于体内 CAR-T 细胞生成的研究都依赖于靶向载体。总体而言,这些研究可以分为两类:一类靶向 T 细胞亚群上的标记物;另一类靶向泛 T 细胞标记物。在后者中,CD3 是一个很常见的选择。与 CD3 不同,CD5 不是 T 细胞效应功能所必需的,但它也在一些 B 细胞上表达。由于载体颗粒附着在靶受体上,因此当靶受体表达下调时,CAR 基因有可能被递送到非 T 细胞上。未来的研究需要对此进行进一步探讨。

CD3 已经成为非病毒载体和慢病毒 (LV) 载体的靶点。针对小鼠 CD3 ε-链进行生物分布评估的研究表明,纳米载体 (NC) 注射到 C57BL6 小鼠体内后不久,主要与 T 细胞结合 (75%的颗粒) ,而25%的 NC 在外周血中粘附于 CD3 阴性细胞 (以B细胞、中性粒细胞和单核细胞为主) 。此外,这种靶向作用将小鼠肝脏中的颗粒负荷降低了3倍,并改善了载体颗粒在脾脏、淋巴结和骨髓中的分布。基因表达的生物分布与颗粒分布非常一致。MCD3-NC 在肝脏中表现出与对照组 NC 相似的报告子活性,但在淋巴组织中的活性却高出3-8倍。虽然大多数报告子活性存在于这些组织的 T 细胞中,但是在 B 细胞,树突状细胞和巨噬细胞等非 T 细胞中也检测到了大量活性。这些脱靶活性大约占到在靶基因转移的20% -30%。为了加深这方面认识,研究人员需要进一步深化在肿瘤细胞转导方面的研究。

两种类型的LV (SINV和NiV) 也已被用于靶向人类 CD3。研究人员使用已激活的 CD3 抗体衍生的单链抗体来靶向含有 NiV 糖蛋白的LV假分型,以实现对 T 细胞的选择性,同时促进对T细胞的基因编辑。这些 CD3-LV 诱导 T 细胞活化和增殖,在缺乏细胞因子或刺激性 CD3/CD28 抗体的情况下,可以有效地转导原代 T 淋巴细胞。在没有任何限制 CD3+CD45+ 细胞的 CAR 信号的情况下,学者们将 CD19-CAR 传递到 CD34+ 造血干细胞 (huCD34+ NSG) 人源化的 NSG 小鼠中,产生了功能正常的 CAR-T 细胞。在此基础之上,Huckaby 等人将含有 CD3 结合部分 (CD3-SINV-LV) 的双特异性串联 Fab 靶向的 SINV-假分型 LV 注入到含有人源 PBMCs 的 NSG 小鼠中。最终分析表明,大约70-90%的 CAR 阳性细胞为 CD3 阳性。

当观测靶向人类泛 T 细胞标志物的载体颗粒的生物分布时,大多数人源化小鼠模型只提供人类细胞中的在靶细胞。相比之下,当 CD4 或 CD8 作为靶受体时,T 细胞亚群提供了在密切相关的人类靶细胞和非靶细胞之间监测靶细胞选择性的机会,因为 CD4+ 和 CD8+ T 淋巴细胞共享绝大多数细胞表面蛋白。

已有学者使用 NiV-假分型 CD8-LV 实现亚群特异性的体内 CAR 细胞生成。研究人员将载体静脉注射到 huCD34+ NSG 小鼠体内,只在血液、脾脏和骨髓中的 CD8+ 细胞中检测到 CAR 信号。类似的,在 T 细胞人源化的 NSG 小鼠中使用 mRNA 传递 hCD8-NCs 也可以获得 CD8+ CAR-T 细胞。值得注意的是,在一项 CD8-LV、NK 和 T 细胞的后续研究中,学者们发现 CD8 T 细胞以外的细胞也表达了 CAR。CD8-LV 对 NK 细胞的靶向转导可能有助于清除肿瘤,因为 CAR NK 细胞也可能具有有效的抗肿瘤效应。

通过展示DARPin (CD4-LV) ,靶向人类 CD4 的 MV-假分型 LV 所产生的 CAR-T 细胞具有令人惊讶的活性。CD4-LV 的给药不仅能使 CAR 在 CD4+ 细胞上特异性表达,而且能使这些 CAR-T 细胞比 CD8-LV 产生的细胞发育得更快,同时它们也能完全消除所靶向的肿瘤细胞。虽然之前已经描述了 CD4+ T 细胞具有良好的细胞毒性活性,但在 CAR-T 细胞领域,CD4+ 和 CD8+ CAR-T 细胞1:1的组合使用仍是公认的清除肿瘤的有效方法。

最近的研究表明,能在患者体内存在十年的主要是 CD4+CAR-T 细胞。此外,同样通过体内方法,CAR-T 细胞可以通过任意比例组合靶向 CD4 和 CD8 的载体,以特异性亚群的方式生成。

剂量和表达动力学

在临床前体内 CAR 细胞生成实验中观察到的表达和效应因子动力学以及实现它们的剂量反映了载体平台不同的作用模式,这些作用会导致永久性或暂时性的基因转移。虽然还没有学者进行直接比较,但就单位动物所需的载体颗粒数量而言,似乎纳米颗粒和 AAV 要比 LV 更高。这可能与 LV 介导的永久性基因转移以及其高靶细胞特异性有关。然而,其他参数,如动力学和细胞进入以及细胞内传递的效率也可能发挥作用。

除此之外,体外和体内 CAR-T 细胞治疗在药代动力学参数上有很大的差异。在传统的方法中,大量的 CAR-T 细胞在给药后立即就能发挥作用。相比之下,利用载体体内递送产生的 CAR-T 细胞会减少几个数量级,然后在体内会随着时间的推移而扩增。

LV 和转座酶激活的 NC 可以稳定地将转基因整合到其宿主染色质中。 因此,单次注射载体就足以诱导生成持续存在的CAR-T 细胞。对于副粘菌假分型 LV,单位小鼠注射4x1010到2.5x1011的颗粒即可发挥作用;而对于 SINV-LV,能发挥作用的单位小鼠剂量为5x1010。

CAR-T 药物动力学依赖于人类免疫成分的激活状态:在用活化的人类 PBMCs 重建的小鼠模型中,CAR-T 细胞 (或靶细胞杀伤) 在载体注射后一到两周内变得明显,因此比在 huCD34-NSG 小鼠中更早发挥作用。此外,峰值 CAR-T 水平在 PBMC-NSG 中高于 huCD34-NSG 小鼠,可以达到靶向T细胞亚型的40%。值得注意的是,在载体给药后长达十八周的完整监测期内,在一些 CD34+ huNSG 小鼠中检测到了 CAR-T 细胞。也有报道称,使用 NC 转移 CAR 质粒和高度活跃的 PiggyBac 转位酶可以实现 CAR 的永久表达,尽管颗粒剂量大大高于先前报道的 LV。在这项实验中, 5天内注射总剂量为1.5 x1012 NC 颗粒,可以使得小鼠体内高达20%的T细胞在注射12天后转变为 CAR 阳性, 10只受试小鼠中有7只成功消除了白血病细胞。虽然这似乎很有希望,但由于转移效率低和对转座酶毒性的担忧,这种策略后来被放弃了,学者们转而专注于 mRNA-NC 的瞬时递送。

在瞬时基因转移中,即当使用非整合载体时,转基因表达最终会丢失。这是由转基因降解和失活以及其在细胞增殖时的稀释造成的。然后,尽管有抗原诱导增殖,但可能仍需要重新给药以维持足够的 CAR-T 细胞水平。事实上,多剂量的 mRNA 转移 PBAE-NC 对于维持抗肿瘤 CAR 活性是必要的。为了治疗T细胞人源化 NSG 小鼠的血液肿瘤和实体瘤,研究人员在6周内施用了6剂50μg,总共300μg 的 mRNA。在急性淋巴白血病的同源小鼠模型中,研究人员需要在4周内施用12剂15μg,总计180μg的 mRNA。人体当量剂量相当于2.08 g/mL的血液,或约10毫克的 mRNA。相比之下,使用 mRNA 的疫苗对成年人类进行完全的新冠疫苗接种是通过 LNPs 中的90-300μg mRNA 来实现的。值得注意的是,实体和液体肿瘤在治疗停止后几周内都会复发,这表明持续的 CAR 活性对于持久的肿瘤抑制是必要的。mRNA 转移的快速动力学可能与这些复发有关,因为 CAR 水平在两天后达到峰值,并且在纳米颗粒输注到 NSG 小鼠7天后几乎完全丧失。

当不需要长期 CAR 细胞活性时,较低的剂量似乎就足够了:纳米颗粒注射三周后的结果表明在 LNP 实验中单次注射10μg FAP-CAR-mRNA 即可减轻纤维化组织的负担,并在纤维化的同源模型中显着改善心脏功能在这种情况下,研究人员更希望利用短期的 CAR-T 细胞活性来减少 CAR-T 细胞对健康成纤维细胞的影响。

通过单次注射剂量为1-2x1011 非靶向 AAV 来递送 DNA 而不是mRNA可以在人源化的 NCG T 细胞白血病小鼠模型中生成 CAR-T 细胞。令人惊讶的是,注射 AAV 35天后,仍能在小鼠体内检测到 CAR-T 细胞。这种意想不到的持续性转基因信号或许与腹腔注射的高转导效率以及 CAR 编码序列自发整合到T细胞基因组有关。在体外,来自靶向 mCD8 的 DART-AAV 的转基因信号在载体添加后一周内几乎完全在活化的小鼠淋巴细胞中丢失了。

安全与控制

对于能够永久转移 CAR 基因的载体研究,一个迫在眉睫的安全问题是,转移基因错位插入宿主染色质导致转录失调而产生的遗传毒性。用第一代自体造血干细胞 (HSG) 体外转导治疗 X 连锁严重联合免疫缺陷的儿童,在载体基因组长末端重复 (LTR) 内在增强子引起 LMO2 等转录因子上调后,非自我失活的γ-逆转录病毒载体在儿童体内诱发了白血病。LMO2 导致了不受控制的克隆扩张。这一事件的发生及后续研究使人们更好地了解了逆转录病毒介导的癌基因插入形成以及自失活逆转录载体和慢病毒载体的使用。值得注意的是,与 HSC 相比,T 淋巴细胞发生逆转录病毒介导的癌基因转化的可能性相对较小。

总体上看,在 LV 介导 T 细胞转导的临床应用里还没有插入性肿瘤发生的事件。但是,也有一些良性扩张的例子。与 LV 相比,转座子介导的基因转移在去年引发了“重症综合性免疫缺陷”,两名患者接受了使用 piggyBac 转座子酶产生的体外 CAR-T 细胞后发展出了 T 细胞淋巴瘤。虽然肿瘤发生的机制仍在调查中,但这一事件必然会迫使大家去发展更安全的转位策略。

鉴于这些安全事件的发生,学者们建议密切监视该领域内的长期研究。对风险因素的关注,如 CAR-T 细胞的载体拷贝数,将确保 CAR 递送的收益大于潜在的基因毒性风险。

除了关注遗传毒性的风险外,对于 CAR 基因的永久转移,人们可能还需要药代动力学工具以更好地控制 CAR 活性,特别是当患者出现严重的细胞因子释放综合征 (CRS) 或免疫效应器细胞相关神经毒性综合征 (ICANS) 时。这两种综合征往往同时出现,其特征是高水平的促炎细胞因子。有趣的是,当使用 CD8-LV 在 CD34+ huNSG 小鼠中产生 CAR-T 细胞时,也会观察到类似 CRS 的症状。这与 CD8+ 细胞在肺、脑、肝和脾B细胞区的浸润以及 IL-6、IFNγ、GM-CSF 和 TNFα 等细胞因子的升高有关。

在临床上,CRS 和 ICANS 患者接受 tocilizumab (一种单克隆抗体) 治疗以减轻全身炎症反应,同时不损害 CAR 的治疗性功能。使用酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼可以实现更精确的控制,该抑制剂已在临床前实验中用于间歇性地关闭 CRS 小鼠模型中的 CAR-T 细胞。它可以减轻炎症负担,提高小鼠生存率。

另一种已经在人体中进行应用的方法是利用装配有可溶性抗原特异性靶向模块 (TM) 的惰性 UniCAR。在这一策略中,对 CAR 的控制是通过选择半衰期较长或较短的 TM 来实现的。一旦所有的 TM 被降解,CAR-T 细胞的活性就会丧失。

除了短期控制策略外,研究人员还可以将可诱导的半胱天冬酶9 (IC9) 自杀基因结合到 CAR 分子上从而实现对 CAR 的长期控制。利用这种方法,医生可以在病人肿瘤被清除后及时停止 CAR 细胞功能。通过小分子给药,诱导 IC9 蛋白二聚化,导致 CAR-T 细胞凋亡。对病情较轻的患者来说,这一机制的存在有可能使得由永久转移载体所产生的 CAR 细胞变得更有吸引力了。重要的是,所有这些控制策略都可以与体内 CAR-T 细胞生成相结合,从而促进这种方法在临床中的应用。

当使用瞬时性转移载体时,失控的 CAR 细胞活性不会成为问题。恰恰相反,目前尚不清楚使用瞬时性转移载体时,CAR 活性是否可以维持足够长的时间以实现持久的肿瘤清除。现有的短期实验安全性数据没有表明严重的急性毒性,然而,合成和病毒载体体内给药后细胞因子水平增加,以及 NC 诱导的补体成分激活和线粒体氧化应激增加,都表明炎症反应可能会影响载体的重复给药。同基因模型的长期实验能够评估载体给药或重复给药后诱发炎症反应和其他宿主免疫反应的风险。

宿主免疫

宿主对给药载体的免疫反应会影响药物的安全性和疗效。抗体介导的对载体颗粒的免疫反应会降低有效在靶颗粒数量,诱发炎症,影响最初给药和重复给药的效果。尤其需要注意病毒来源的 LV 和 AAV 载体,因为它们具有明显的免疫原性。

事实上,对啮齿类动物的单次系统注射已被证明可诱导形成对抗病毒粒子和 VSV-LV 包膜蛋白的中和抗体。尽管目前没有针对 AAV 的疫苗,但有相当比例的人携带了针对 AAV 的中和抗体。虽然携带修饰 mRNA 的 LNP 的免疫原性似乎是可接受的,但是引入用于受体靶向的蛋白质成分可能会增加重复给药后抗体形成的风险。血浆置换法去除血清 IgG 是一个耗时的过程,需要复杂的仪器,替代方法是使用链球菌 IgG 降解酶,如 IdeS。使用 IdeS 的系统治疗不仅可以对已携带抗 AAV8 抗体的猕猴进行肝转导,而且可以有效地实现多次给药。

吞噬作用是载体颗粒被清除的另一个因素。在用 CD3 靶向 NC 治疗的小鼠中,约20% 的巨噬细胞和单核细胞均为 NC 阳性,表明这些细胞都对载体具有吞噬活性。值得注意的是,吞噬作用似乎不受靶向的影响,因为它能够同样影响 CD3-NC 和同种型 NC 的粒子分布。在使用 LV 和腺病毒载体的肝脏转导实验中,研究人员观测到非线性剂量反应。当到达阈值剂量时,大多数给药颗粒都被驻留在肝脏的 Kupffer 巨噬细胞隔离了。将吞噬抑制剂 CD47 结合进载体颗粒,可以减少 LV 的吞噬作用。细胞培养中巨噬细胞对这种颗粒的摄取会减少,另外,这种载体在非人灵长类动物中会获得更高的hFIX转移效率。研究人员在 CD4 和 CD8 靶向 LV 的包装细胞中,也观察到了类似的效应。巨噬细胞的存在使常规 CD4 和 CD8-LV 在人T细胞上的平均转导效率降低了约25-50%,然而抑制了吞噬作用的载体就可以大大提高基因转入T细胞的能力。此外,在重建了人骨髓细胞生理水平的 CD34+ HSC 人源化 NSG-SGM3 小鼠中,抑制吞噬作用的载体实现了更有效的体内 CAR-T 细胞生成和更显着的靶细胞清除。

走向临床

使用前沿的载体平台技术,CAR-T 细胞可以在体内生成并清除肿瘤细胞。毫无疑问,这是 CAR 治疗和基因治疗的一个里程碑。然而,我们仍然需要更多研究去探索永久或暂时性的转移方法中涉及的短期、中期和长期的安全性和有效性问题最近或早先报道的基因治疗死亡事件敦促我们:在推进首次人体试验之前,需要在长期临床前研究中更彻底地检查载体对宿主的影响。

除了确保患者安全外,严格表征每个载体与宿主的相互作用将有助于我们了解先天免疫和获得性宿主免疫是如何干扰载体给药,从而导致药物毒性失效和载体颗粒清除的,以及如何最好地调节宿主免疫系统以应对这种干扰。这一点至关重要,因为当针对淋巴细胞时,我们无法进行广泛的免疫抑制或淋巴清除。因此,我们必须确定调节方案,最小化与载体给药和免疫介导的粒子剂量损失相关的炎症,同时保持淋巴细胞的活力和活性。具有完全免疫功能的同源模型将有助于这方面的研究。这些实验所需的小鼠T细胞靶向载体可出自于所有四种载体平台,已经有学者报道通过 DARPin 靶向小鼠 CD8 的 LV 和 AAV。

另一个关键问题是载体制造,因为足够数量的高质量载体库存对于进一步开发至关重要。靶向载体生产过程的设计应符合良好生产规范 (GMP) 的要求。为生产靶向 LV、AAV 和 LNP 开发符合 GMP 的工艺,可以参考先前为已批准药物生产非靶向 GMP 级载体的相关经验。虽然新冠疫苗的全球推广已经表明合成颗粒生产具有相当大的可扩展性,然而细胞产生的靶受体结合物是否能在不影响产量的情况下整合到生产过程中仍有待确定。

此外,在体内 CAR 治疗的背景下,在解决宿主免疫和载体制造问题 (以及其他尚未确定的问题) 方面取得的进展可能会使整个基因治疗领域受益。这些突破将帮助许多急需治疗的患者获得血液、心脏、传染病和发育疾病方面的体内治疗。通过靶向载体技术的发展以及学者们持续不断的严格工作和坚韧决心,基因治疗领域或许很快就会进入 “体内时代”。

参考资料

Michels, Alexander, Naphang Ho, and Christian J. Buchholz. "Precision Medicine: In Vivo CAR Therapy as a Showcase for Receptor-Targeted Vector Platforms." Molecular Therapy (2022).

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关键词:
细胞,体内,靶向,小鼠,载体

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