对纳米抗体分子内的额外二硫键说Yes or NO？

前言

纳米抗体因其分子量小、结构简单、人源化程度高，已被越来越多生物医药企业创新药研发管线布局所选择。在2018年全球首款纳米抗体药物Caplacizumab在欧盟获批上市，2019年2月被美国FDA批准上市，用于治疗成年获得性血栓性血小板减少性紫癜（aTTP）。2019年和2020年该药物全球销售规模约5600万欧元，2020年销售额11300万欧元，增加105.4%；Caplacizumab在我国还被纳入了《第三批临床急需境外新药名单》。在国内2021年11月，由康宁杰瑞、思路迪和先声药业合作开发的重组人源化PD-L1单域抗体（研发代号：KN035；通用名：恩沃利单抗注射液）在中国获批上市，适用于不可切除或转移性微卫星高度不稳定（MSI-H）或错配修复基因缺陷型（dMMR）的成人晚期实体瘤患者的治疗。目前，在双特异抗体和细胞治疗上，也有越来越多的公司选择使用纳米抗体，比如金斯瑞生物子公司传奇生物与强生子公司杨森共同开发、生产的一款用于治疗多发性骨髓瘤的 CAR-T 产品cilta-cel(JNJ-4528)，该产品是差异性结构的CAR-T细胞疗法，包含一个4-1BB共刺激结构域和两个靶向BCMA双表位的纳米抗体结构域，具有促进CD8阳性T细胞扩增的能力。

在纳米抗体开发过程中，选择性质优异的抗体序列分子可以为后期成药打下坚实的基础，但是在纳米抗体发现中我们经常会遇到CDR3含有半胱氨酸的问题，至于为什么会经常遇到CDR3会含有半胱氨酸的问题，可以参阅《纳米抗体开发时“草泥马”的选择》一文，里面详细介绍了纳米抗体开发过程中动物选择和纳米抗体分子内二硫键相关内容。当纳米抗体CDR3含有半胱氨酸，这就会导致纳米抗体除了正常的23位与104位形成二硫键外，常常在CDR1或FR2与CDR3之间形成额外的一对二硫键(图1)，这对额外二硫键虽然能够让抗体保持很好的稳定性，但是在工艺开发上往往容易导致二硫键的错配，同时有文献研究表明[2-3]，将纳米抗体CDR3中半胱氨酸突变去掉，虽然不会对抗体亲和力产生较大的影响，但是会降低抗体的热稳定性(图2)，而抗体的热稳定性对于抗体药物的重要性是不言而喻的。那么含有分子内额外二硫键的纳米抗体到底有没有成药的可能性呢？本文将参考目前上市或者专利中的纳米抗体来进行探讨。

图1 人类、羊驼、骆驼、鲨鱼、鸡和牛抗体中额外二硫键分布情况[1]

图2 纳米抗体野生型(VHH WT)和纳米抗体突变体(C24A-C98A-C24A/C98A)亲和力以及热稳定性检测结果

Caplacizuma

Caplacizuma是获得批准的第一款专门针对aTTP的疗法，也是第一款获得批准的纳米抗体疗法。Caplacizumab是赛诺菲（Sanofi）公司旗下的Ablynx公司研发的一种纳米抗体。Caplacizumab(ALX0081)是一种二价纳米抗体药物，由两个抗vWF的人源化纳米抗体串联组成，其纳米抗体氨基酸序列见图3，由图中序列可知道，该药物纳米抗体序列中CDR3氨基酸序列为AAGVRAEDGRVRTLPSEYTF，CDR3中不含有半光氨酸，意味着抗体蛋白不存在额外二硫键分布。查询Ablyx的专利，发现Ablyx公开的序列中未发现两对二硫键的序列，这就说明Ablyx在考量纳米抗体分子成药时还是担心额外分子内二硫键对成药性会产生一些不利的影响。

图3 Caplacizumab(ALX0081)纳米抗体序列(来自于发明专利申请说明书CN201980011292.X)

思沃利单抗注射剂（KN035）

恩沃利单抗注射液(KN035)是一种由纳米抗体(VHH)和Fc段组成的单特异性抗体，分子量是完整抗体分子量的一半，是全球第一个且目前唯一获批上市的皮下注射PD-(L)1抗体。该药物纳米抗体氨基酸序列见图4，由图4可以看出，该药物纳米抗体序列中CDR3氨基酸序列为AADSFEDPTCTLVTSSGAFQY，CDR3中含有半光氨酸，抗体蛋白CDR1和CDR3之间形成额外二硫键SS2(图5a)，这就是使得抗体分子结构更加稳定。该药物的成功上市说明含有额外二硫键的纳米抗体是可以成药的。

图4  恩沃利单抗注射液(KN035)纳米抗体序列(来自于发明专利申请说明书CN201510465481.8)

图5 KN035/PD-L1整体结构[4](a为KN035序列和结构，b为KN035/PD-L1结合结构)

图6 KN035晶体结构[5]

其他一些专利中纳米抗体情况

我们查询了国内一些纳米抗体药物开发企业公开专利中纳米抗体序列情况(表1)，发现仍然有企业选择含额外分子内二硫键纳米抗体作为后期潜在的成药分子。迈威生物和启愈生物针对PD-L1靶点的纳米抗体专利CN113527488A和CN112142842A中所述的纳米抗体CDR3均含有半光氨酸，均为含有额外二硫键的纳米抗体，这两个针对PD-L1的纳米抗体后期成药开发均是考虑用于双特异抗体中。洛启生物针对TIGIT靶点的纳米抗体专利CN111718415A中所述的三条纳米抗体，其中一条CDR3均含有半光氨酸，为含有额外二硫键的纳米抗体。两个专注于细胞治疗创新药物研发的企业传奇生物和普瑞金生物，在纳米抗体专利WO2021008610A1和CN109134665A中所述的纳米抗体CDR3均不含有半光氨酸，那么是否是因为额外二硫键形成会对后期产品产生影响，这里需要更多数据来进行支撑。

表 1 其他一些专利中纳米抗体情况

总结

当前纳米抗体已经被应用于G蛋白偶联受体等基础医学研究、PET等医学影像以及单抗、双抗和细胞治疗等疾病治疗之中，纳米抗体开发时分子内额外二硫键纳米抗体是否可以成药这一问题从已经上市或者专利中一些纳米抗体来看，只要抗体分子结构稳定，不影响后期工艺开发，同时满足特定的应用场景，含有额外分子内二硫键纳米抗体也具有成药的潜在可能。

????参考文献：

[1] Chowdhury P S, Prabakaran P. Landscape of Non-canonical Cysteines in Human VH Repertoire Revealed by Immunogenetic Analysis[J]. Cell Reports, 2020.

[2] Liu H, Schittny V, Nash M A. Removal of a conserved disulfide bond does not compromise mechanical stability of a VHH antibody complex[J]. Nano letters, 2019, 19(8): 5524-5529.

[3] Mendoza M N, Jian M, King M T, et al. Role of a noncanonical disulfide bond in the stability, affinity, and flexibility of a VHH specific for the Listeria virulence factor InlB[J]. Protein Science, 2020, 29(4): 990-1003.

[4] Zhang F, Wei H, Wang X, et al. Structural basis of a novel PD-L1 nanobody for immune checkpoint blockade[J]. Cell discovery, 2017, 3(1): 1-12.

[5] http://www.alphamabonc.com/pipeline/kn035.html