实用干货 | PCR实验常见问题及解决方法

FOCUS ON IVD CHINA

▶   聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制，PCR 的最大特点是能将微量的 DNA 大幅增加。

你在做 PCR 实验的时候遇到过哪些问题？    来看看前辈们的经验。  

没有 ct 值

检  测结果遇到没有 Ct 值情况,排查是否有以下问题:  

01   循环数不够  (一般不超过 45 循环，不仅背景值提高,定量也不准);  

02   PCR 程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误  。一般 SG 法采用 72 ℃ 延伸时采集，TaqMan 法则一般在退火结束时或延伸时采集信号，另外荧光采集是否选中。  

03   引物或探针降解  。可通过 PAGE 电泳检测引物和探针是否降解;  

04   模板量可能降解或上样量不足  (不超过 500 ng，根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解，应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况，建议将模板样本小量分装储备，避免反复冻融;  

05   引物探针是否合适  (尤其是引物跨越内含子，以确保扩增基因组DNA；上下游引物 Tm 值超过 4 ℃ 以上也会影响扩增)。  

ct 值过晚

在相对定量中, Ct 值一般控制在 15 ~ 25 之间比较好，如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品，Ct 值会增大, 但是一般不宜超过 40 循环, 否则定量不准确。    

因此，判断 Ct 值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。  

01   扩增效率低  。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化；引物或探针设计不合理，需要重新设计；  

02   PCR 程序不合适  , 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度；退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长 10 s)；  

03   MgCl2 浓度不合适  ，增加镁离子浓度等。PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足；  

04   PCR 产物太长  。PCR 产物设计超过 500 bp；  

05   模板中存在抑制物  。用高纯度模板进行 PCR 检测或将模板进行稀释。   

阴性对照扩增有信号

  阴性对照扩增有信号排查各操作环节是否有不当,造成交叉污染:

01   引物设计不够优化  。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。  

02   引物浓度不佳  。适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度配比。  

03   镁离子浓度过高  。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的 mix 试剂盒。  

04   模板有基因组的污染  。RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增。  

05   交叉污染  。在所用的试剂中有交叉污染, 或操作环境中有气溶胶造成污染, 建议对操作环境进行处理, 或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。    

标准曲线不佳

标准曲线线性关系不佳 R2 < 0.9，很有可能是以下环节存在问题:

01   标准品稀释或者加样误差  ,使得标准品不呈梯度。

02   标准品出现降解  。应避免标准品反复冻融,将高浓度 DNA 模板分装,保存于 -20 ℃ 或 -80 ℃，现配现用。  

03   引物或探针不佳  。重新设计更好更稳定的引物或探针。  

04   模板中存在抑制物  。模板浓度过高,根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求，一般模板量以 50 ~ 500 ng 为宜。    

熔解曲线峰不特异

熔解曲线峰不特异很有可能是以下环节存在问题:

01   引物设计不够优化  。应避免引物二聚体和发夹结构的出现；引物浓度不佳, 尤其是涉及二聚体存在时, 适当降低引物浓度, 并注意上下游引物的浓度比例;  

02   模板有基因组污染  。RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入, 或通过引物设计避免非特异性扩增。  

03   离子浓度不合适  。适当降低镁离子浓度, 或选择更适合的 mix 试剂盒, 不同试剂盒在该方面的优化能力不适合, 有些情况下可以通过更换试剂盒改善结果。   

扩增曲线异常

遇到扩增曲线异常，比如 S 型曲线等等情况,有可能是以下环节存在问题：

01   模板的浓度太高或者降解。

02   荧光染料的降解  。  

03   人为污染  。在操作荧光定量 PCR 时，带上新的一次性手套,盖上避免任何指纹或者字迹等。  

04   液体挥发  。耗材气密性等问题引起液体蒸发,没有很好的聚集在管子里;  

05   气泡  。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题。   

扩增效率低

该情况适用于针对所有的基因,特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时,应考虑如下情况:

01   反应试剂中部分成分比例是否最佳，另外考虑荧光染料是否降解  。  

02   反应条件不够优化  。可适当降低退火温度或改为三步扩增法,适当延长变性退火时间。  

03   反应体系中有 PCR 反应抑制物  。一般是加入模板时所引入的,应先把模板适度稀释，再加入反应体系，减少抑制物的影响。

-End-

来源 | 检验医学

编辑 | 王迪

打赏