Nature子刊:科学家开发新技术,仅需单次注射就能治疗HIV感染

2022
06/21

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人类免疫缺陷病毒(HIV)攻击免疫系统,削弱人体对许多感染和某些癌症的防御能力,而这些感染和癌症对拥有健康免疫系统者而言本可以战胜。

人类免疫缺陷病毒(HIV)攻击免疫系统,削弱人体对许多感染和某些癌症的防御能力,而这些感染和癌症对拥有健康免疫系统者而言本可以战胜。随着病毒破坏和损害免疫细胞功能,感染者的免疫系统会逐渐出现缺陷。

根据世界卫生组织,艾滋病毒仍然是一个主要全球公共卫生问题。截至2020年底,估计有3770万艾滋病毒感染者。2020年,有68万人死于艾滋病毒相关原因,150万人感染艾滋病毒。不可忽略的事实是,目前仍然没有针对艾滋病毒感染的治愈方法。因此,开发有效的艾滋病毒治疗方法迫在眉睫。

体外移植工程化B细胞,可以分泌广泛中和抗体(bNAbs)。根据最新的研究进展,这种方法可以用来生产抗HIV抗体,是一种安全、有效和可扩展的方法,可以帮助开发出艾滋病疫苗。

2022年6月9日,来自特拉维夫大学的Adi Barze团队在Nature biotechnology上发表了题为In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice的研究性论文,称找到了一种新的、独特的艾滋病治疗方法,即使用两种腺相关病毒载体对体内B细胞进行了改造,一种编码金黄色葡萄球菌Cas9 (saCas9),另一种编码3BNC117,一种抗HIV bNAb,将载体静脉注射到小鼠体内后,可产生高滴度的抗HIV广泛中和抗体(bNAb)。

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首先,研究人员对体内B细胞进行了改造,使用了两种腺相关病毒载体(AAV-DJ vectors),一种编码金黄色葡萄球菌Cas9 (saCas9),另一种编码3BNC117,一种抗HIV bNAb。在第一组实验中,saCas9由CMV启动子表达,单向导RNA靶向saCas9至免疫球蛋白重基因座(IgH)。反过来,bNAb在IgH增强子依赖性启动子的控制下被编码为双顺反子盒,并在IgH基因座的 J-C内含子内与所需的saCas9切割位点同源臂两侧。bNAb盒包括完整的轻链和重链的可变区段(VH)。剪接供体序列跟随VH基因片段,以使其与恒定IgH外显子融合,整合到基因座中并随后进行转录和剪接。这种设计有助于破坏内源性IgH 基因座和作为膜BCR的初始 bNAb 表达,随后在抗原结合上激活工程化B细胞,从而导致分化为记忆细胞和浆细胞。

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之后,将工程化B细胞载体静脉注射到小鼠体内,即对小鼠进行免疫,检测体内的抗HIV中和抗体的滴度,发现体内工程化B细胞为高anti-HIV中和抗体滴度。此外,观察到体内工程化B细胞在生发中心——脾脏,进行克隆扩增。提示工程化B细胞良好的增殖能力。

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为了评估体内工程方法可能的脱靶效应,首先在各种组织中,量化了中和抗体基因的拷贝数。在第37天,在肝脏中发现中和抗体基因具有高拷贝数,并且在第136天水平仅降低了10倍。从第37天到第136天,骨髓中的AAV拷贝数显著增加,并且在淋巴结中也检测到了不显著的相似趋势,表明这些组织中可能积累了3BNC117表达细胞。然后,研究者使用来自治疗小鼠和阴性对照小鼠的肝脏和脾脏的gDNA,对四个潜在的脱靶位点、以及在靶位点进行了靶向测序。相对于来自未经治疗小鼠脾脏的对照DNA突变率较高的趋势,表明在肝脏而不是脾脏中,CRISPR-Cas9诱导的双链DNA断裂修复容易出错,而且只在IgH上的靶点,而不是在任何其他检测的脱靶位点。这说明CRISPR–Cas9脱靶切割率极低,而通过从B细胞特异性启动子表达saCas9减少了其它组织中靶向切割的产生。

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为了更好地表征不同的工程细胞群在体内分布聚集情况,接下来使用编码GFP的供体载体以及3BNC117盒。在分析骨髓和脾脏中的GFP和/或3BNC117表达之前,将受体小鼠免疫两次。结果与预期相符,GFP+、3BNC117+细胞在接受供体和saCas9载体的小鼠脾脏和骨髓中富集。与供体和saCas9载体共注射增加了B细胞表达GFP的比率,特别是脾脏中B细胞表达GFP和3BNC117的比率。值得注意的是,在表达GFP的B细胞中,共注射saCas9 载体导致脾脏和骨髓中的3BNC117+、CD138+浆母细胞显著增加。

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为了进一步提高本方法的安全性,研究者在B细胞特异性启动子CD19的控制下对saCas9进行编码。即用20 μg HIV gp120免疫C57BL/6小鼠,6天后每只小鼠与一个编码saCas9的载体共同注射,由CD19启动子、以及编码bNAb和sgRNA 的第二个载体调控。随后小鼠接受了多达六次额外的免疫接种。在四次免疫接种后,接受治疗的小鼠血液中已含有高达2 μg ml-1的3BNC117中和抗体。第四次免疫后45天,使用 ELISPOT可以在骨髓中检测到相似的3BNC117分泌细胞率。

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为了评估对生物分布和安全性的可能影响,在与donor+sgRNA载体和编码saCas9的第二种载体(该载体在广泛启动子或B细胞特异性CD19启动子的控制下)共同注射后3天,小鼠被实施安乐死,并进行组织分析。在CD19或脾病灶形成病毒 (SFFV) 启动子的调控下,编码saCas9的载体获得了相似的转导率。然而,CD19启动子显著降低了肝脏中saCas9的表达,而不降低外周血单核细胞中的表达。仅当使用CMV或SFFV启动子而不是CD19启动子来驱动saCas9表达时,肝脏或脾脏中的靶向切割率显著高于背景。因此,在B细胞特异性启动子下,在两个AAV之间分离saCas9和sgRNA的编码,并表达saCas9,可以将不想要的切割减少到检测限以下,同时在免疫后呈现高3BNC117滴度。

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对于难以攻克的HIV治疗,这项研究无异于带了点点曙光。通过对B细胞进行工程改造,可以在体内分泌高滴度的广泛中和抗HIV抗体,CRISPR–Cas9脱靶切割几率极低,而且减少了不需要组织中的靶向切割。这是一种安全且有效的方法,未来的应用前景非常广泛,不仅适用于传染病的治疗,还适用于非传染性疾病的治疗,如癌症和自身免疫性疾病。期待未来,B细胞工程化改造能够用于临床,造福千千万万的艾滋病病人。

撰文 | 雨雪霏霏

编辑 | 小耳朵

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关键词:
细胞,表达,编码,小鼠,载体

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