PCR定性实验的检出限与测定下限

作者：同济大学附属东方医院胶州医院---王晓燕

检出限和测定下限是化学分析中非常重要的性能指标。它们具有很高的应用价值和控制要求。在不同的工艺条件、规格、设备和仪器条件下，检出限与测定下限不同。因此，在实际工作中，必须坚持具体条件具体分析的工作原理，科学确定具体条件下检出限和测定下限的标准参数，并以此为依据确定，对测量结果的准确性和可靠性进行评价和优化，实现化学分析值的实际提高。

文件查阅

在PCR 定性试验中，CANS-CL02-A009明确提出了测定下限的性能验证要求;CANS-CL02明确规定了检出限的验证方法与判断标准：

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实验设计

下面，我们就由本实验室A提取试剂、A提取仪、A扩增试剂、B扩增仪组成的新冠核酸检测系统，进行最低检测限（A扩增试剂说明书最低检测限为200copies/ml）的验证和检出限的检测。实验结果如图示：

（绿色）内参

（橙色）ORF1ab

（蓝色）N

第三方质控品康彻斯坦S6（500copies/ml）扩增结果

第三方质控品康彻斯坦S6稀释（200copies/ml）扩增结果

第三方质控品康彻斯坦S6（100copies/ml）扩增结果

第三方质控品康彻斯坦S6稀释（50copies/ml）扩增结果

第三方质控品康彻斯坦S6（25copies/ml）扩增结果

第三方质控品康彻斯坦S6稀释（12.5copies/ml）扩增结果

实验结果

表1： 检出限和测定下限的实验结果

实验结论

以上组成的检测系统中，红色字体为A扩增试剂的第三方弱阳性质控品浓度：500copies/ml，检出率100%；蓝色字体为根据说明书声称的最低检测限（检测下限）的浓度：200copies/ml，检出率100%；绿色字体为检出限浓度：25copies/ml。

知识拓展

01

分析化学中检出限与测定下限的定义

“检出限”这一概念最早由德国学者凯撒在1947年提出的，其强调应将检出限视为分析化学中的一项重要指标。从目前来看，对于检出限的定义尚未统一。

（1）IUPAC 认为 ：“检出限”即在特定分析流程下，基于待测物最小分析信号所获得的最低质量或浓度。

（2）EPA 认为 ：“检出限”为在确保待测物在分析样本中浓度大于0时，能够被检测出的，且能以99％以上置信度产出报告的最低浓度。

（3）欧盟在《执行关于分析方法运行和结果解释的欧盟委员会指令》中提出了“CCα”与“CCβ”2种“检出限”概念。前者主要指在不小于 CCα 的浓度条件下，基于误差率 α 获得的阳性测定结论 ；后者主要指被测样品在误差率 β 时可被测定出的最低浓度或最少含量。

对这些定义方式进行综合看待，可得到“检出限”的总结性定义 ：在较高的置信度背景下，通过特定分析工艺、检测流程获得且可定性的，分析样品中待测物的最低浓度或最小量 [1]。

“测定下限”指的是在特定允差范围内，利用分析化学方法对待测物实现精准化测定的最低定量限值。不同的地区背景、研究组织下，测定下限的规定要求也不尽相同 。

（1）IUPAC 规定，测定下限应为“空白测量值标准偏差的10倍相对应的浓度值”，约是检出限浓度的3.3倍左右，并需要保证测定下限的报告置信水平达到90％以上。

（2）EPA 规定，测定下限应为标准检出限的4倍浓度值。

（3）JIS 规定，测定下限应为检出限的10倍浓度值。

从目前来看，我国分析化学领域主要依照 IUPAC 的相关规定开展实践活动，即把检出限浓度值的3.3倍作为测定下限。除此之外，在绘制待测物的工作曲线时，可观察到标准曲线在达到某个浓度值后会呈现明显弯曲，此时将低浓度区域的直线与该弯曲节点进行连接，连接点所处的具体浓度值或含量值，也可视为相应待测物的测定下限。

02

分析化学中检出限与测定下限的相互关系

主要从方法检出限的角度入手，对检出限与测定下限的相互关系进行评价。从本质上讲，方法检出限更倾向于描述定性检测背景下待测物的极限浓度或量级，以此回答分析样本中“是否含有待测物”的问题。测定下限则倾向于描述特定精度要求下待测物的定性检测浓度或量级，以此回答分析样本中“待测物有多少”的问题。由此可知，相对来讲可信度高、符合标准的定性数据应处在检出限与测定下限两者之间，即测定下限＞定性数据≥检出限。在此背景下，检出限与测定下限的接近程度越高，定性数据的测定结果也就越精准。通俗地讲，检出限向测定下限逐渐趋近的过程，就是分析化学中检测数据由定性向定量发展的趋优过程，也即由“雾里看花” 式的模糊认知向“明察秋毫”式的清晰认知逐步深入的过程。

参考文献

[1] 刘栋，李妍 . 探讨分析化学中几项分析性能指标 [J]. 广州化工， 2019，47（8）：137-138，172.

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编辑：青翠欲滴

校审：晨晨