Future Medicine设计：计算模型HALA辅助解决ADC疗法痛点

在实体瘤治疗中，高剂量ADC可提高组织渗透性和疗效。但为了避免细胞毒性载荷，高剂量ADC依靠较低的药物/抗体比，或联合应用非结合抗体载体剂量来实现。虽然这些策略对高度表达的靶点有效，但对于表达程度较低的靶点可能无法保持有效性。

为了解决这个问题，作者利用计算模型设计了一种高亲合力（Avidity）、低亲和力(Affinity)（HALA）载体抗体，在高表达细胞中ADC结合能受到部分阻断，从而提高组织渗透性。

HALA抗体不能与低表达细胞中的ADC竞争，从而能让ADC与大多数受体结合。因此，载体剂量的竞争量会自动调整到表达水平，从而允许不同患者、转移瘤之间的定制竞争。计算模型强调了两个无量纲数，即Thiele模量和新定义的竞争数，来为所有靶点设计最佳HALA抗体载体剂量。 

*  亲合力是指整个抗体分子与抗原物质之间的结合强度

   亲和力是指一个免疫球蛋白分子单体的一条重链与一条轻链所构成的抗原结合部位与抗原决定簇之间的结合力。

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ADC面临挑战

抗体药物偶联物（ADC）是一类快速发展的癌症治疗药物，在过去3年中获得了7项新的批准，目前有11个已获批的ADC，还有数百个ADC正在进行临床或临床前开发。

ADC由与癌细胞结合的抗体和通过连接器连接的细胞毒性有效载荷组成。这种疗法具有很大优势，因为它们能将具有高度特异性的抗体的和化疗细胞杀伤潜力相结合，然而因为在向肿瘤输送大分子时仍面临挑战，以及带有毒性的小分子，ADC在过去二十年中遭遇了多次失败。多变的肿瘤微环境以及狭小治疗指数也给ADC的发展带来了挑战。

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ADC优化策略

（1）三种扩大治疗窗基本思路

有许多策略可以优化抗体和ADC化学特性，以扩大治疗窗口并提高疗效。抗体和ADC在肿瘤微环境中分布不均匀，既具有靶表达的功能，又能在组织内快速结合（结合位点屏障效应）。

虽然增加剂量是使抗体均匀分布的常用技术，但ADC剂量因其有效载荷而受到毒性的限制。目前扩大治疗窗主要有三种思路：

（2）HALA策略的提出

将未结合抗体和相应的ADC联合给药是降低效力和增加组织渗透性的一种可行方法。Kadcyla，曲妥珠单抗与Kadcyla剂量之比接近8:1时可提高异种移植肿瘤的ADC疗效。由于未结合抗体的剂量较高，因此它们与ADC竞争并阻断部分细胞受体，使ADC能够深入肿瘤以提高疗效。然而，许多载体剂量研究集中于高表达靶点（106个受体/细胞）。对于表达水平较低的靶点，载体剂量的益处会减少，而在表达水平足够低的情况下，如果没有足够的有效载荷能进入细胞来让细胞死亡（例如（104–105个受体/细胞）），则效率会降低。

在这项工作中，模拟了一种新的高亲合力低亲和力载体抗体（HALA），来确定它是否可以通过原位调节肿瘤微环境中的竞争性阻断来克服这一限制。HALA抗体的单价结合亲合力比ADC弱；因此，假设HALA抗体在亲合力强的高表达肿瘤中与ADC竞争，会将ADC进一步推入肿瘤以提高疗效。然而，在亲和力效应较弱的低表达肿瘤中，ADC将胜过HALA抗体，从而产生高ADC结合和疗效。本质上，HALA抗体能够自动调整同一患者不同转移瘤内的竞争，甚至同一肿瘤内的细胞，以最大限度地提高疗效。该模型的示意图见图1。

图1 通过合用HALA抗体载体剂量改善ADC分布 

为了指导HALA抗体的开发，使用经验证的单层细胞、肿瘤球体中二价结合的机制模型以及Krogh圆柱体模型在体内模拟HALA与ADC的竞争。研究结果为深入了解ADC分布对联合应用HALA抗体结合亲和力、受体表达和内化率的依赖性提供了依据。模拟结果可用于优化与ADC共同施用HALA抗体亲和力的设计，以实现与表达异质性无关的最大功效。

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HALA创新实验

（1）材料和方法

三个经验证的计算模型（复杂性不断增加）用于描述HALA抗体特性对细胞、组织以及在体内的影响：

第一个模型是二价竞争动力学模型，该模型用于在细胞单层上测量HALA抗体与ADC的竞争。

第二个模型在模拟中结合了竞争动力学以及目标内化和抗体扩散，该模型改变了肿瘤球体中HALA抗体的结合亲和力和浓度，以确定根据亲和力变化的最大ADC效能。

最后，将竞争动力学模型集成到Krogh圆柱体模型中。Krogh圆柱模型是一个多尺度模型，它结合了药代动力学、药效学现象，如受渗透性、血浆清除率、有效载荷释放和旁观者杀伤限制的转运，其中有效载荷可自由扩散到相邻细胞中。该模型根据肿瘤表达和HALA抗体特性变化来模拟抗体竞争和有效载荷分布。

（2）三种实验模型

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单层竞争模型

采用动力学模型模拟HALA抗体与ADC在单层上的竞争。开发了两种二价抗体之间竞争的计算模型。即让HALA抗体和ADC竞争开放结合位点。单价结合的HALA抗体或ADC可以解离或以二价形式结合。同时，自由结合位点与新的HALA抗体或与靶点结合的ADC竞争。图2中描述了该现象的概要。

图2 ADC与HALA抗体的竞争动力学 

微分方程由反应网络定义，初始竞争参数由文献计算或确定（具体方程见原文献）

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球体竞争模型

二价竞争模型适用于具有扩散的球形几何体，使用先前验证的模型模拟球体中的ADC分布。微分方程、参数和变量见补充资料。 

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克罗圆柱模型

球体模型无法捕捉血管通透性、血浆清除率和释放后的有效载荷分布。因此，竞争模型适用于先前验证的Krogh圆柱体几何结构，以模拟血管化肿瘤中的ADC和有效载荷分布。由于浓度沿毛细管长度变化很小，Krogh圆柱体模型假定为径向分布而非轴向分布。间隙压力升高导致组织中的对流有限，主要是扩散传输。

在这个模型中，抗体和ADC竞争上述可用的结合位点。在与细胞受体结合后，ADC（或HALA抗体）被内化到细胞中，抗体被降解，从而让有效载荷杀死细胞。包括两种类型的有效载荷：亲水性和亲脂性有效载荷。亲水性有效载荷被捕获在目标细胞内，而亲脂性有效载荷可以扩散到细胞外并进入周围细胞（旁观者效应）

（3）实验结果

通过模拟亲和力变体与具有不同细胞表达水平的细胞的结合IgG量来验证该模型。验证后，推导出一个表达式“ψ”来描述HALA抗体的有效竞争。它本质上是细胞受体内化与结合竞争之间的比率，见图3：

图3 两种抗原（三角形）强调二价相互作用。基于高亲和力ADC的不可逆结合，定义了无量纲“竞争”数ψ 

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HALA竞争无量纲数 

ADC和HALA抗体之间的竞争动力学的简化描述得到开发，其中ADC的结合被认为是不可逆的（高亲和力）。推导出无量纲数ψ，以捕获HALA抗体与高亲和力ADC竞争的能力。

在硅片中添加抗体的几分钟内，ADC和HALA抗体都能显著结合靶点。由于许多抗体的kon率相似（koff通常用来区分高亲和力抗体和低亲和力抗体），结合ADC和HALA抗体的数量与其在溶液中的浓度成比例。在数小时内，高亲和力ADC开始超过HALA抗体，增加ADC结合量。然而，一旦受体被内化，ADC就不能再竞争结合。ADC相对于内化率的竞争率表示为ψ，取决于受体表达水平。在低ψ值时，HALA抗体结合不良，ADC在结合位点上胜过HALA。在高ψ时，HALA抗体能够与ADC竞争，直到抗原被内化。

为了验证无量纲数，作者进行了数值模拟，并绘制了ψ与P（HALA抗体结合量相对于初始浓度）的关系图。当P=1时，HALA结合量与初始剂量成正比，因此在8:1 HALA抗体与ADC的比率下，HALA抗体结合的受体比ADC多8倍。如果P小于1，则ADC相对于每种药剂的初始浓度超过HALA抗体，如果P大于1，则HALA结合超出ADC（未显示，因为这意味着更高的亲和力HALA抗体）。通过改变ψ的各个参数来验证ψ与P之间的关系。无论单个参数如何变化，在ψ值较高时，P值收敛到1，在ψ值较低时，P值随条件而变化。结果如图4所示。

图4 ADC和HALA抗体之间的竞争动力学

结合的HALA抗体和ADC与散装培养基中HALA抗体和ADC的比率（P）与ψ的比率表明，当ψ值为10或更多时，HALA抗体成功地与ADC竞争结合。无量纲数捕获的竞争速率与参数的变化无关.

（4）建模类型

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建模球体

 先前的研究表明，曲妥珠单抗与T-DM1以8:1的比例联合给药可以使TDM-1进一步穿透肿瘤，从而获得最佳的体内疗效。在这项工作中，竞争性抗体的亲和力是不同的，以确定在不同表达水平下对组织渗透和细胞摄取的影响。请注意，绘制的浓度是针对球体中心的细胞，通常低于外围细胞。模拟表明，大多数ADC在结合亲和力在1至20 nM之间、初始HALA抗体浓度在40 nM至80 nM之间时到达球体中心，在5 nM Kd时具有最佳穿透力，HALA抗体浓度为40 nM（图4A）。使用曲妥珠单抗在体内表现良好的亲合力和剂量，这种基本情况被标记为“最佳”。保持与“最佳”条件相同的结合亲和力，但增加或减少HALA抗体浓度，导致ADC穿透力降低，这被标记为“过度竞争”（载体剂量过大）或“浓度受限”（载体剂量过小）。保持最佳浓度但降低结合亲和力导致低渗透，标记为“亲和力受限”。补充图S4中显示了球体中心ADC浓度的更一般化图，其中绘制了值与ψ和蒂勒模量φ2的关系图。尺寸值（即浓度和Kd）通常更直观，因此在整个主要图形中使用。

图5 模拟球体中的ADC分布

图4B、C显示了ADC和HALA抗体在球体内的穿透力，作为距离/半径的函数。亲和力限制点在球体边缘显示出较高的ADC浓度（超过细胞死亡所需的浓度），但在靠近球体中心的位置，浓度迅速降低，导致疗效有限。

在这些条件下，极低亲和力的HALA抗体在球体边缘竞争激烈，但到达中心。相比之下，该模型在最佳条件下显示出均匀的ADC分布。如果载体剂量过高，由于HALA抗体的大剂量，过度竞争点显示出低ADC浓度。整个球体中的HALA抗体浓度大且均匀。浓度限制点显示在球体边缘ADC穿透略有改善；然而，穿透力下降超过100微米时。HALA抗体也会同时缺乏组织渗透性。

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Krogh圆柱体建模 

在检查HALA抗体特性对ADC在球体中分布的影响后，使用Krogh圆柱体模型在体内模拟ADC分布。该模型包括血管通透性、血浆清除率和旁观者有效载荷分布。

启动模拟使用Krogh圆柱体模型，改变类似于球体模型HALA抗体的结合亲和力和浓度，以捕获ADC和细胞毒性有效载荷的分布。该模型首先捕获Kadcyla释放的细胞毒性有效载荷的ADC，赖氨酸-SMCC-DM1（简称DM-1）则是一种非旁观者有效载荷。接下来，模型用MMAE（一种旁观者有效载荷）模拟ADC，两个结果在联合给药后48小时后显示。

图6 48小时后，在Krogh圆筒模拟中，ADC的分布和ADC与HALA抗体联合给药的有效载荷显示出浓度和结合亲和力的变化 

如图6所示，ADC分布受结合亲和力和HALA抗体浓度的影响。随着血浆中HALA抗体初始浓度的增加，结合亲和力必须降低，以补偿并保持良好的肿瘤穿透性。48小时后ADC和有效载荷分布之间的差异可归因于内部化的差异。补充图S7展示了ADC和有效载荷浓度根据ψ和φ2变化的更具代表性的曲线图。

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设计最佳HALA抗体 

使用HALA抗体作为载体剂量的目的是使高效穿透高表达肿瘤，同时避免细胞、肿瘤之间的竞争，以及受体表达降低。因此，从设计角度来看，应根据对一系列受体表达水平的摄取来选择最佳亲和力。为了实现这一点，将有效载荷分布模拟为亲和力和受体表达的函数，以选择最佳亲和力。由于先前的实验表明，在高表达肿瘤中使用Kadcyla靶向HER2时（基于ADC的耐受性），这是一个最佳的体内给药比例，因此HALA与ADC的比例固定在8:1，其他系统的最佳比率将取决于ADC的最大耐受剂量和使肿瘤饱和所需的抗体剂量。HALA抗体的结合亲和力在1 nM到10μM之间变化，表达范围在10000个rec /cell到1000000个rec /cell之间。

图7 48小时后改变抗体剂量和亲和力的最佳HALA的设计。48小时后在Krogh圆筒模拟中，随浓度和肿瘤表达的变化，共同给药的ADC-HALA抗体的ADC分布和有效载荷

图7显示了ADC到达远离肿瘤血管系统的细胞的分布（在克罗柱的边缘），较强结合的HALA抗体可增加对高表达肿瘤的渗透，而较弱结合的HALA抗体适合低表达水平，然而，在20nM左右，HALA抗体能够增加高表达肿瘤的摄取，同时维持中等表达肿瘤的有效载荷摄取，图7B显示了以MMAE作为有效负载的ADC。它表现出与DM1类似的行为；然而，8:1的比例不足以在1.8毫克/千克ADC剂量下实现完全穿透，因此最大ADC结合发生在较少的受体/细胞上，根据这些图，可以选择最佳的HALA抗体亲和力，通过适当选择HALA抗体特性，在高表达细胞上的竞争是有效的，可以将组织穿透力提高数倍，然而，低表达细胞上的竞争很弱，尽管溶液中的HALA抗体浓度高出八倍，但大多数受体仍能与ADC结合。

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讨论

ADC的组织渗透性差是其疗效的主要限制因素，并阻碍了ADC更广泛的临床成功。较高的抗体剂量，无论是通过较低的DAR、更耐受的有效载荷，还是增加载体剂量都可以提高疗效，同时降低健康组织中的靶向介导摄取，以改善治疗窗口。然而，较低（有效）的DAR也会降低低表达模型的疗效。为了克服这一限制，作者模拟了高亲和力、低亲和力（HALA）载体抗体的分布，以确定其对分布的影响。模拟结果表明，这种抗体可以改善高表达模型中的组织渗透性，而不会与低表达肿瘤或细胞中的ADC显著竞争（图1），这种方法可以与其他策略（如更高效力、位点特异性ADC）协同作用，以靶向这些低表达细胞。

当目标表达较高时，HALA抗体以二价结合（具有高亲和力），使其能够与高亲和力ADC竞争。在低表达水平下，HALA抗体结合单价（低亲和力），导致ADC产生更大的竞争和结合。然而，实际竞争比图表更复杂，亲和力受价、亲和力、表达密度、链接器格式等影响，具有低（单价）亲和力的抗体仍然可以以非常高的亲和力结合，在高表达细胞上产生低的“有效”KD 。然而，在存在高亲和力抗体/ADC的情况下，由于抗体“摆动”，这种低亲和力试剂将迅速从细胞表面竞争。需要更详细地描述细胞表面的结合和竞争，以确定有效的HALA抗体。

当细胞暴露于HALA和ADC抗体的混合物中时，结合率占主导地位。由于抗体的开启率相似，HALA抗体与ADC结合的初始比率与浓度（或体内剂量）成正比。与多个反应系统类似，ADC和HALA抗体受动力学控制。结合由开启速率决定，开启速率与溶液中的浓度成比例。随着时间的推移，高亲和力ADC开始与低亲和力HALA抗体竞争，以接近热力学平衡。在很长一段时间内，抗体/ADC都会达到平衡或热力学控制，其中亲和力较高的ADC主导结合。然而，当靶向活细胞时，这种竞争会在有限的时间内发生，直到靶细胞被内化。如果HALA抗体能在这段时间内胜过ADC，它能有效地竞争结合，从而允许更深的组织渗透。如果从动力学控制到热力学控制的转变速度快于内化速度，那么ADC的竞争将超过HALA抗体，换句话说，如果从动力学控制到热力学控制的转变速度慢于内化，抗体就会被“捕获”在其动力学控制状态中，竞争量由ψ决定，即结合竞争和内部化之间的比率。这项工作的目标是优化动力学，使HALA抗体在高表达细胞而非低表达细胞上胜过ADC，因此，高表达细胞的ψ较大，低表达细胞的ψ较小。 

然而，由ψ决定的有效竞争不足以确保所有细胞中ADC有效负载的高摄取。总抗体剂量（ADC加HALA抗体）也需要克服组织中的局部代谢。因此，增加对球体中心的穿透有两个要求。

当Thiele模量接近1时，HALA抗体和ADC的剂量达到饱和，从而克服了内化。如果HALA抗体的剂量过高，则Thiele模量将非常低，使肿瘤过饱和，降低ADC摄取。为了保持良好的穿透力，ψ也必须在10左右。如果该值远远大于10，ADC将很好地穿透高表达肿瘤。然而，即使在靶向表达较低的肿瘤中，ψ值仍将保持较高，并且HALA抗体将与ADC过度竞争这些低表达细胞。

体内模拟的Krogh圆柱体模型增加了血浆清除率、血管通透性和旁观者效应等额外影响。然而，这种补充的复杂性并不能定性地影响抗体在组织中的分布，总剂量（ADC加HALA抗体）必须足以克服内化，并且亲和力必须足够高，以实现有效竞争。为简单起见，假设两种抗体的血浆清除率相同。

T-MMAE和T-DM1的曲线形状在Krogh圆柱体模型中相似。需要足够的剂量和HALA抗体竞争，以促进深入组织的渗透。总的来说，T-MMAE的旁观者效应显示出更好的分布到细胞中，并且能够在更广泛的结合亲和力和受体表达范围内维持150 nM的抗肿瘤活性最低浓度。这表明，显示旁观者效应的有效载荷可以部分补偿不良ADC组织穿透或异质靶点表达的异质分布，这与临床经验一致，然而，正如在其他系统中所看到的，较高的ADC组织穿透比依靠旁观者效应克服组织穿透限制更有效。

为了优化设计用作载体剂量的HALA抗体，可以将远离肿瘤血管的细胞中ADC有效载荷的摄取绘制为HALA抗体亲和力和受体表达的函数。通过足以在高表达肿瘤中实现有效的组织穿透，但在低表达条件下不与ADC竞争的亲合力，可以在一系列表达水平上实现最佳的原位竞争和最大的功效。

最终，有效的ADC治疗需要积极的治疗窗口，在这个窗口中。相对于毒性，治疗方案可以取得的显著疗效， 因此，HALA抗体对毒性的潜在影响特定讨论。由于HALA抗体预期具有良好的耐受性（类似于典型的单克隆抗体），因此预计它们自身不会增加大多数靶点的毒性。由于大多数ADC的毒性是非靶向介导的，HALA抗体预计不会显著增加或降低毒性。相反，他们希望通过对毒性的影响可以忽略不计，同时显著提高疗效，从而改善治疗窗口，然而，应注意的是，在某些情况下，靶向介导的毒性是显著的（例如TROP-2）。在这些情况下，HALA抗体预计不会在低表达组织中竞争结合， 因此，在具有显著靶向介导毒性的情况下，为了降低健康组织中的摄取以降低毒性和增加肿瘤穿透以提高ADC疗效，应用更高亲和性抗体载体剂量（或较低DAR）可能更合适。

结 论

高亲合力、低亲和力（HALA）抗体可作为最佳载体剂量，以提高ADC在细胞表达范围内的疗效，即使在同一患者或同一肿瘤内。单层、球体和Krogh圆柱体模型中的机理模拟提供了ADC分布对共同管理的抗体结合亲和力、受体表达和内化率的依赖性的见解，数据表明，优化与ADC共同施用的抗体亲和力可以使竞争和内化之间的比例达到最佳，从而实现最大的功效。

参考文献

1. Evans, R., & Thurber, G. M. (2022). Design of high avidity and low affinity antibodies for in situ control of antibody drug conjugate targeting. Scientific reports, 12(1), 7677. https://doi.org/10.1038/s41598-022-11648-0

本文由仁域生物提供。

——本期完——

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