作者解读|内蒙古农大张和平团队：口服巴氏杀菌益生菌发酵乳可减轻DSS诱导的大鼠炎症性肠病

编译：微科盟九卿臣，编辑：微科盟小编、江舜尧。

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导读   炎症性肠病（IBD）的发病机制与炎症损伤和肠道疾病的生物多样性密切相关。饲喂发酵乳可作为一种膳食干预策略，向消费者提供具有生物活性的营养物质。本研究旨在研究巴氏杀菌益生菌发酵乳对大鼠葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的IBD的缓解作用。结果显示，灌胃巴氏益生菌发酵乳可显著降低DAI评分，减轻结肠损伤，降低血清肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6水平。此外，巴氏杀菌益生菌发酵乳改善了肠道微生物丰富度指数，有益菌显著增加，宿主炎症相关物种减少。巴氏杀菌益生菌发酵乳干预也改变了肠道功能宏基因组，氨基酸、核苷酸和维生素生物合成途径显著富集。综上所述，摄入巴氏杀菌益生菌发酵乳通过减少炎症反应和恢复肠道菌群缓解IBD。      

论文ID

原名：Oral administration of pasteurized probiotic fermented milk alleviates dextran sulfate sodium-induced inflammatory bowel disease in rats

译名：口服巴氏杀菌益生菌发酵乳减轻DSS诱导的大鼠炎症性肠病

期刊：Journal of Functional Foods

IF：4.451

发表时间：2022.6.6

通讯作者：张和平

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

DOI：10.1016/j.jff.2022.105140

实验设计

通过基础发酵剂（YF904）单独培养或与四种选定益生菌菌株（   Bifidobacterium an   i   malis    subsp.   lactis   Probio-M8，   Lactiplantibacillus plantarum    Lp-6，   Lactobacillus helveticus    H9，   Lacticaseibacillus paracasei    PC-01）共发酵生产的两种巴氏杀菌发酵乳，利用非靶代谢组学测定两种巴氏杀菌发酵乳中的代谢产物，靶向代谢定量测定发酵液中短链脂肪酸和有机酸的含量。然后利用两种发酵乳干预进行动物实验，将32只大鼠随机分为4组（每组8只，每笼2只）：对照组（接受无DSS的无菌水）、 DSS组（DSS诱导的IBD模型组）、DSS+FM组（加入5% DSS和2ml巴氏杀菌普通发酵乳）、DSS+PFM组（加入5% DSS和2ml巴氏杀菌益生菌发酵乳）。第15天，大鼠在异氟醚麻醉后处死，收集血液、结肠组织及粪便样本用于各项指标测定。  

图1 实验设计图

结果

1 利用靶向和非靶向代谢组学检测巴氏杀菌益生菌发酵乳中的代谢物 

通过质谱检测到的三次独立运行的质控样品的覆盖总离子色谱（TICs；ESI+和ESI-如图S1所示）均显示出稳定且高度重叠的峰形，证实了色谱/仪器条件的良好稳定性和数据重现性/可靠性。此外，QC样本的符号聚类在PCA评分图中（图2A），表明样品信号检测时色谱条件高度稳定。表示巴氏普通发酵乳和益生菌发酵乳的符号在PCA评分图上形成了明显的聚类模式，说明两种发酵奶的代谢组存在明显差异。与巴氏杀菌普通发酵乳相比，巴氏杀菌益生菌发酵乳中有127个丰富的代谢物显著增加（ P <0.05）。

其中，通过KEGG数据库注释了巴氏杀菌益生菌发酵乳中显著增加的代谢产物共72种，分别为多肽、脂类、有机酸、氨基酸和核苷（图2B）。通过聚类热图分析进一步分析这些代谢物。 肽代谢物的聚类热图分析表明，巴氏杀菌普通乳和益生菌发酵乳之间的肽图谱是不同的（图2C）。大多数多肽代谢物被鉴定为由3~4个氨基酸组成的寡肽，这可能是这些益生菌菌株具有较强的蛋白水解能力的结果，特别是 Lactobacillus helveticus  H9。

此外，与普通发酵乳相比，巴氏杀菌益生菌发酵奶中15种脂类化合物含量显著增加（图2D）。除了肽和脂类代谢物外，巴氏杀菌益生菌发酵乳中含有的氨基酸（如L-酪氨酸、L-丝氨酸）、维生素B6（如吡哆沙明）以及已知具有抗氧化活性的代谢物（如乳清酸、草酸和白藜芦醇）等营养物质明显多于普通巴氏发酵乳（图2E）。采用超高效液相色谱法（UPLC）和质谱法（MS）定量测定了巴氏普通发酵乳和益生菌发酵乳发酵液中短链脂肪酸和有机酸的含量。巴氏杀菌益生菌发酵乳中丁酸、琥珀酸和苯甲酸的含量显著高于巴氏普通发酵乳（ P <0.05），而乙酸、丙酸和己酸的含量增加不显著（图2F-G）。   

  图2 巴氏杀菌发酵乳代谢物。 （A）主成分分析（PCA）得分图；质控组（QC）、巴氏普通发酵乳和益生菌发酵乳；三个平行。（B）甜甜圈图。与巴氏杀菌普通发酵乳相比，巴氏杀菌益生菌发酵乳代谢产物显著增加。（C-D）肽和脂类代谢产物聚类热图分析。（E）除多肽和脂类外，其他有益代谢物显著增加。（F-G）有机酸和短链脂肪酸的靶向代谢组学分析。数据以平均±标准差表示。采用Wilcoxon检验进行统计学分析。*代表P<0.05。 

2 巴氏杀菌益生菌发酵乳可减轻DSS诱导的IBD大鼠的疾病严重程度 

建立DSS诱导的IBD大鼠模型（自由饮水7d），评价巴氏杀菌益生菌发酵乳对IBD的缓解作用。通过对IBD大鼠体重和DAI评分的变化来评估IBD大鼠的疾病严重程度。对照组大鼠体重在整个实验过程中稳步增加，而DSS显著减缓了体重增加（图3A， P <0.05）。灌胃巴氏益生菌发酵乳使大鼠体重恢复到与对照组相似的水平，也显著高于DSS组（图3B， P <0.05）。

与DSS组相比，巴氏杀菌普通发酵乳使DSS处理大鼠的体重增加无显著差异（图3B）。 DSS给药后DAI评分（通过体重减轻、粪便一致性和粪便潜血评分相加计算）显著升高（ P <0.001，对照组比DSS组；图3C），经巴氏杀菌益生菌发酵乳处理后，降低至与对照组相似的水平（ P >0.05，对照组与DSS+PFM组比较）。相比之下，巴氏杀菌普通发酵乳对大鼠DAI评分的降低不显著，与DSS组差异不显著（ P >0.05；图3D），且显著高于对照组和DSS+PFM组（两组均 P < 0.05；图3D）。以上结果表明，只有巴氏杀菌益生菌发酵乳才能有效缓解DSS诱导的大鼠IBD。     

图3 巴氏杀菌益生菌发酵乳可减轻DSS诱导的IBD大鼠的疾病严重程度（n=8）。 

（A）和（C）大鼠DSS诱导过程中体重增加和疾病活动指数（DAI）评分的变化。数据以平均±标准差表示。（B）和（D）第15天体重和DAI评分。框中的水平条表示整个数据集的中位数。箱子的上边缘和下边缘分别代表第75和第25百分位。晶须代表数据集的上25%和下25%，并排除异常值。采用Wilcoxon检验进行统计学分析。*代表P<0.05；**代表P<0.01，***代表P<0.001。 

3 巴氏杀菌益生菌发酵乳减轻了DSS诱导的IBD大鼠的结肠损伤 

DSS处理大鼠结肠较未处理大鼠明显缩短，巴氏杀菌普通乳或益生菌发酵乳对这种病理作用均有保护作用（图4A）。结肠长度/结肠重量比值可反映结肠水肿状况；比例越小表示严重的结肠水肿，反之亦然。DSS组大鼠结肠长度/结肠重量比显著低于对照组（ P <0.05；图4B），证实了DSS摄入对严重结肠组织水肿的有害作用。

巴氏杀菌益生菌发酵乳干预对上述作用有明显的保护作用，DSS组与DSS+PFM组差异有统计学意义（ P <0.01；图4B），但饲喂巴氏杀菌普通发酵乳对这种损上伤的保护效果不明显（ P >0.05，DSS组与DSS+FM组比较；图4B）。 光镜下对四组大鼠结肠组织切片进行H&E染色观察并评分。DSS组在各组中得分最高，表明DSS诱导结肠远端组织损伤，表现为严重的上皮细胞脱落、结缔组织增生、炎症和水肿。饲喂巴氏杀菌普通乳或益生菌发酵乳可显著降低结肠组织学评分（ P <0.01，DSS组与DSS+FM组比较； P <0.001，DSS组与DSS+PFM组比较；图4C），但在补充巴氏杀菌普通发酵乳的情况下，这种保护作用较弱（ P <0.01，对照组与DSS+FM组比较； P >0.05，对照组与DSS+PFM组比较；图4C）。结肠远端组织病理组织学结果一致。对照组结肠组织H&E染色切片结构完整，单层结肠粘膜柱状上皮完整。上皮细胞形态结构正常，固有层杯状细胞较多，肠腺丰富，无明显炎症（图4D）。

DSS组染色结肠组织切片显示上皮细胞脱落，局部固有层肠腺数量减少，结缔组织增生，大量炎性细胞浸润，水肿，睾丸腺间距增宽（图4D）。DSS+FM组染色的结肠组织切片出现较低程度的水肿，与结肠长度/结肠重量比减少相一致；DSS+PFM组结肠结构相对完整，黏膜损伤较少。与DSS组相比，DSS+FM组和DSS+PFM组的组织病理学损伤程度明显降低，摄入含或不含益生菌的巴氏发酵乳均能有效促进DSS诱导的结肠黏膜组织损伤的恢复，而益生菌组的保护作用更强（图4D）。 通过监测血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的水平来评估巴氏益生菌发酵乳对IBD大鼠炎症状态的影响（图4E）。DSS治疗组TNF-α水平显著升高（ P <0.01，DSS组与对照组比较），IL-6和IL-1β水平无显著升高。饲喂巴氏杀菌益生菌发酵乳可显著降低部分促炎因子水平（TNF-α， P <0.05；IL-6， P <0.01；DSS组与DSS+PFM组比较）。各组间血清IL-1β、IL-10水平差异无统计学意义。    

图4 巴氏杀菌益生菌发酵乳处理可减轻DSS诱导的IBD大鼠结肠损伤（n=8）。 

（A）结肠外观的代表性图片。（B）结肠长度与结肠重量之比。（C）组织学得分。（D） H&E染色结肠组织切片的代表性显微照片（放大倍数20×和200×）。（E）血清白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的浓度。统计学分析采用Fisher最小显著性差异检验。*代表P<0.05；**代表P<0.01，***代表P<0.001。 

4 给予巴氏杀菌益生菌发酵乳可调节DSS诱导的IBD大鼠肠道菌群的多样性和结构 

IBD的发病机制与结肠的炎症状态直接相关，与宿主肠道菌群密切相关；由此，我们研究了发酵乳对大鼠肠道菌群多样性和结构的影响。采用Shannon指数和丰富度指数分别评价肠道菌群多样性和丰富度（图5A）。与对照组相比，DSS组细菌多样性显著降低（ P <0.05），说明DSS处理可破坏宿主肠道菌群。DSS+FM组和DSS+PFM组的Shannon指数均不显著高于DSS组。

DSS组与对照组丰富度指数相似，但在巴氏杀菌发酵乳干预下显著升高（ P <0.05），说明食用巴氏杀菌发酵乳提高了肠道菌群丰富度。 采用PCoA（Bray-Curtis距离；图5B）分析不同组肠道菌群整体结构的变化。虽然代表不同组的符号在PCoA评分图中存在一些重叠，但永久结果显示组间存在显著性差异（R 2 =0.17， P =0.02）。DSS处理显著增加了大鼠肠道菌群的个体间差异（ P <0.001，DSS组与对照组比较；图5B，右面板），这一结果在饲喂发酵乳（含或不含益生菌）后明显逆转（DSS组与DSS+FM、DSS+PFM组之间分别为 P <0.01、 P <0.001；图5B，右面板），说明饲喂发酵乳可以降低个体间肠道菌群异质性，可能有助于恢复DSS处理导致的肠道菌群结构。   

  图5 巴氏杀菌益生菌发酵乳可调节DSS诱导的IBD大鼠肠道菌群多样性和组成（n=8）。 

（A） Alpha多样性箱线图（Shannon指数和丰富度指数）。（B）主坐标分析（PCoA，Bray-Curtis距离；adonis检验）和Bray-Curtis距离的差异。（C）摄入巴氏杀菌益生菌发酵乳后，菌种明显减少。（D）摄入益生菌和普通巴氏发酵乳后，菌种显著增加。（E）对摄入巴氏杀菌益生菌发酵奶特别敏感的关键微生物种类。采用Wilcoxon检验评估统计学差异。*代表P<0.05；**代表P<0.01，***代表P<0.001。 

5 饲喂巴氏杀菌益生菌发酵乳可调节DSS诱导的IBD大鼠肠道菌群组成 

比较了4组大鼠的肠道菌群组成。共有两个优势门，厚壁菌门和拟杆菌门。与对照组相比，3个DSS处理组的厚壁菌门水平均升高，而拟杆菌门水平下降（图S2A）。科水平上，主要科（>1%）包括氨基酸球菌科， Akkermansiaceae ，拟杆菌科，梭菌科，毛螺菌科，乳杆菌科， Muribaculaceae ，胃链球菌科，普雷沃氏菌科和瘤胃球菌科。在这个水平上，大鼠组之间的差异更小（图S2B）。 

为了进一步明确肠道菌群在IBD发病机制中的作用，鉴定了各组间物种水平差异丰富的细菌。共发现22种菌对巴氏杀菌益生菌发酵牛奶干预有反应。与对照组或DSS组相比，DSS+PFM组的 Muribaculaceae  sp.， Alistipes ihumii ， Alistipes shahii 和 Pseudoflavonifractor capillosus 数量显著减少（P < 0.05）， Lachnospiraceae sp.   也较DSS组少，但不显著（图5C）。

与对照组或DSS组相比，DSS+FM组和DSS+PFM组中存在显著增多的 Alistipes senegalensis ， Lactobacillus animalis ， Lactobacillus johnsonii ， Bacteroides intestinalis ， Bacteroides thetaiotaomicron ， Parabacteroides merda ， Clostridium  sp. ASF356， Romboutsia timonensis ， Anaerofustis stercorihominis 和 Alistipes obesi 。与对照组或DSS组相比，DSS+PFM组明显检测出更多的 Akkermansia muciniphila ， Dorea  sp. CAG:317， Clostridium  sp. CAG:306， Azospirillum  sp. CAG:239， Enterococcus faecalis ， Bacteroides oleiciplenus 和 Bacteroides acidifaciens （图5E）。 

6 巴氏杀菌益生菌发酵乳对DSS诱导的IBD大鼠肠道宏基因组潜力的调节 

由于巴氏杀菌益生菌发酵乳对肠道菌群的调控，可以预见肠道宏基因组潜力的变化。分析各组间差异代谢途径。DSS组和DSS+PFM组之间共发现16条差异代谢通路。基因编码途径，如糖异生I、甲基赤藓糖醇磷酸途径II、肽聚糖生物合成、淀粉降解V、糖酵解III、CDP-二酰基甘油生物合成和丙酮丁醇梭菌产酸发酵在DSS组显著富集，而与硫胺素形成、生物素生物合成、8-氨基7-氧壬酸生物合成I和4-氨基2-甲基5-磷酰基嘧啶生物合成相关的基因编码途径显著 在DSS+PFM组中较高（图6A）。此外，与DSS+FM组相比，DSS+PFM组的KEGG代谢通路（主要与核苷酸和氨基酸生物合成相关）显著富集。L-苯丙氨酸生物合成丰度则呈相反趋势（图6B）。表明，饲喂巴氏杀菌益生菌发酵乳可有效调节肠道菌群及其潜在功能。 

7 肠道菌群与临床参数的关系 

为了解释IBD相关症状的缓解机制，计算了显著改变的肠道微生物与血清炎症因子水平、组织学评分、DAI和上述差异代谢通路之间的Spearman相关性，相关热图显示了显著的结果（ P <0.05；图6C）。 组织学评分与 Parabacteroides merdae ， Lachnospiraceae  sp.， Clostridium  sp. ASF356和 Bacteroides thetaiotaomicron 呈显著正相关，且DSS组4种细菌的丰度显著高于对照组。对照组DAI最低，与 Muribaculaceae  sp.呈负相关，与肠道菌群丰度变化趋势一致。

此外，与对照组或DSS组相比，DSS+PFM组的 Alistipes ihumii 和 Pseudoflavonifractor capillosus 明显减少；这两个物种与糖异生I、糖酵解III和CDP-二酰基甘油生物合成途径呈正相关。与对照组或DSS组相比，DSS+PFM和DSS+FM组中 Alistipes senegalensis ， Lactobacillus animalis ， Lactobacillus johnsonii ， Bacteroides intestinalis ， Romboutsia timonensis ， Anaerofustis stercorihominis 和 Alistipes obes i 显著增加；它们通常与大多数已确定的差异代谢途径呈负相关。   

  图6 巴氏杀菌益生菌发酵乳处理可调节DSS诱导的IBD大鼠的肠道宏基因组潜力（n=8）。

（A） DSS组与DSS+PFM组代谢途径差异。（B） DSS+FM组与DSS+PFM组代谢途径差异。柱状图显示了不同代谢途径的平均比例。比例的差异以95%的置信区间显示，只有P<0.05 （FDR调整后）显示。（C）肠道菌群与临床参数之间的Spearman相关性。正相关和负相关分别用红色和蓝色表示。色彩强度与斯皮尔曼相关性的强度成正比。*代表P<0.05；**代表P<0.01。

讨论

IBD患者的肠道菌群发生了改变，这可能也是导致IBD发病的原因之一。目前，对于IBD还没有有效的临床治疗方法，而摄入发酵乳已被证明可以恢复肠道菌群的非生物状态。因此，本研究旨在探讨巴氏杀菌益生菌发酵乳对DSS诱导的IBD大鼠的有益作用及其机制，重点研究其对肠道菌群的影响。 发酵产品对预防和减轻炎症性肠病的疗效以前曾有报道。灌胃含枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌的发酵乳通过抑制炎症反应、促进黏膜屏障重建和调节肠道菌群缓解DSS诱导的IBD。大麦和大豆的混合发酵液也显示出通过增强肠道屏障功能缓解肠炎小鼠的临床效果。

同样，本研究结果显示，饲喂巴氏发酵乳后，IBD相关症状得到明显改善，且饲喂巴氏益生菌发酵奶的大鼠的症状缓解效果明显强于饲喂巴氏普通发酵奶的大鼠。体重的变化也反映了大鼠的健康状况。与未治疗的对照组大鼠相比，DSS诱导的结肠炎治疗组大鼠的体重增加明显减少，提示DSS治疗对大鼠的生长产生了有害影响；而提供巴氏杀菌益生菌发酵乳至少可以部分地保护这种不良反应。 目前的研究和以前的研究的一个主要区别是，这里应用的发酵乳经过高温短时间巴氏杀菌步骤，这足以有效地消灭除芽孢外的所有营养形式的微生物。

因此，所见的有益作用可能是由产品中存在的代谢物所赋予的。代谢组学分析发现，与巴氏杀菌普通发酵乳相比，巴氏杀菌益生菌发酵乳中短肽、短链脂肪酸、有机酸以及一些具有抗氧化活性的小分子物质的含量明显增加。因此，这些分子可能是缓解IBD症状的生物活性物质，并部分逆转DSS诱导大鼠的组织损伤和炎症反应。此外，巴氏杀菌益生菌发酵乳中其他显著增加的代谢物也具有良好的功能特性。总之，巴氏杀菌的益生菌发酵牛奶具有良好的益生菌潜力。 

本实验使用了DSS诱导的IBD大鼠模型，表明口服巴氏杀菌益生菌发酵乳和巴氏普通发酵乳在较小程度对减轻IBD大鼠结肠组织炎症损伤的有效性，同时血清促炎因子（TNF-α和IL-6）水平降低，肠道菌群丰富度增加，部分逆转了DSS诱导的肠道生态失调。并富集基因编码的生物合成途径的有益代谢物，包括氨基酸，核苷酸和维生素。因此，目前的观察结果和巴氏杀菌发酵乳在缓解IBD方面的功效值得通过大规模临床试验进行进一步研究。此外，尽管发酵乳代谢组学和肠道微生物组分析提供了有助于缓解IBD相关症状的潜在生物活性代谢物和代谢途径的线索，但它们在IBD中的确切作用和功能需要进一步探索。

结论

总之，摄入巴氏杀菌益生菌发酵乳通过减少肠道炎症反应和恢复宿主肠道菌群，减轻DSS诱导的IBD，为巴氏杀菌发酵乳的进一步开发提供理论依据。然而，该研究观察到的由特定益生菌制备的巴氏杀菌发酵乳缓解IBD的效果，应通过大规模临床试验进一步研究。此外，尽管提供了潜在生物活性代谢物和代谢途径的提示，它们有助于缓解IBD相关症状，但它们在IBD中的确切作用和功能仍需进一步研究。

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