快报 | 全基因组测序对初治耐多药肺结核菌株耐药谱的预测：一项来自结核病高流行地区的研究

Prediction of drug resistance profile of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-MTB) isolates from newly diagnosed case by whole genome sequencing (WGS) : a study from a high tuberculosis burden country.

Sun W, Gui X, Wu Z, Zhang Y, Yan L.

BMC Infect Dis, 2022, 22(1): 499.

doi: 10.1186/s12879-022-07482-4.

PMID: 35624432.

近日，《BMC传染病》（BMC Infectious Diseases）杂志在线发表了同济大学附属上海市肺科医院结核科的一项使用全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）对由表型药物敏感性试验（DST）鉴定的初治耐多药结核分枝杆菌菌株进行耐药谱预测的研究[Prediction of drug resistance profile of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis（MDR-MTB）isolates from newly diagnosed case by whole genome sequencing (WGS) : a study from a high tuberculosis burden country. doi: 10.1186/s12879-022-07482-4]。研究试图阐明WGS对于高流行地区耐多药菌株的快速鉴定能力，为合理的治疗奠定基础。上海市肺科医院结核科的孙雯雯医师为本文的第一作者，闫丽萍医师为通信作者。

研究背景

耐多药结核分枝杆菌（MDR-MTB）的出现和传播已经是一个全球性健康问题。中国的耐多药结核病（MDR-TB）患者约占全球总数的14%。快速、准确的药物敏感性试验（DST）是有效治疗的基础，也是目前MDR-TB管理的一个挑战。基于MTB培养的表型DST（pDST）方法是目前耐药检测的金标准，其缺点是耗时、需要先进的实验室基础设施、合格的工作人员和严格的质量保证机制、无法检测培养阴性的耐药菌株，以及缺乏统一的耐药界值。此外，某些药物，如吡嗪酰胺（PZA），因其杀菌作用须在酸性环境中才能充分发挥，使得常用的培养基不能用于PZA的pDST。MTB的耐药机制主要是由于编码药物靶点或转换酶的基因突变，包括单核苷酸多态性（SNPs）、插入和缺失等。检测耐药基因突变的最大优势为快速性，但在准确性方面仍然有待进一步研究证实。由于MDR-TB治疗需要多种药物组合，往往需要分别分析相应的基因位点来预测完整的耐药谱。近期的研究表明，WGS可以准确全面地预测MTB的耐药性，但目前仍缺乏在结核病高负担地区的数据。故本研究利用WGS对初治MDR-MTB分离菌株进行抗结核药物耐药基因谱的鉴定，并与基于MGIT 960培养和最低抑菌浓度（MIC）的pDST金标准进行比较。我们的目的是评估WGS对预测我国初治MDR-MTB菌株耐药谱的能力。

研究方法

我们收集了2018年1月1日至2020年12月30日收治的初治MDR-TB患者的痰液或支气管肺泡灌洗液，使用BACTEC MGIT 960系统进行分枝杆菌培养，使用MycoTB MIC plate检测12种常用抗结核药物的耐药性。本试验的MDR-MTB菌株收集自从未接受过抗结核治疗（ATT）或接受抗结核药物治疗少于1个月的初治MDR-TB患者。研究最终筛选出43株初治MDR-MTB进行了WGS检测。将WGS获得的SNPs数据与世界卫生组织发布的与耐药相关的MTB基因突变目录进行比对，获取基于WGS预测的基因型耐药谱。采用IBM SPSS Statistics version 22.0软件（IBM Corp. Armonk, NY, USA）对纳入患者的耐药特点和WGS在耐药鉴定方面的能力进行统计总结和分析。

研究结果

在纳入的初治MDR-MTB菌株中，pDST显示：有79.1%（34/43）的菌株对链霉素（Sm）耐药、30.2%（13/43）的菌株对乙胺丁醇（EMB）耐药、74.4%（32/43）的菌株对利福布汀（RFB）耐药、18.6%（8/43）的菌株对莫西沙星（Mfx）耐药、16.3%（7/43）的菌株对左氧氟沙星（Lfx）耐药、Mfx和Lfx的交叉耐药率达7/8，而对环丝氨酸（Cs）、对氨基水杨酸（PAS）和乙硫异烟胺（Eto）敏感的菌株分别为97.7%（42/43）、93.0%（40/43）和93.0%（40/43）。97.7%的菌株存在ropB基因耐药突变，其中S450L突变最为常见（54.8%）。86.0%的菌株携带过氧化氢酶和过氧化物酶编码基因（katG）S315T位点突变。92.9%（13/14）的EMB耐药菌株携带embB基因耐药突变，其中6株（46.15%）为M306V突变，3株（23.1%）为M306L突变；29株对EMB敏感的分离株中，8株（27.6%）携带EMB耐药突变基因，其中7株为embB突变、1株为embA突变。34株对Sm耐药的菌株中，31株（91.2%）携带Sm耐药突变基因，其中25株（80.6%）为rspl基因突变、3株（9.7%）为rrs基因突变、3株（9.7%）为rspl和rrs基因同时突变；Sm耐药突变基因中以rpsl K43R突变最为常见。7株Lfx耐药株中有5株发生gyrA突变，36株Lfx敏感株中有1株（2.0%）发生gyrA突变。8株Mfx耐药菌株中，5株发生gyrA突变，1株发生gyrB突变；35株Mfx敏感株中，1株（2.9%）出现gyrA突变。本研究仅发现了1例阿米卡星（Am）和卡那霉素（Km）耐药菌株，该菌株发生rrs突变，同时存在gyrA基因突变；然而，在42例Am/Km敏感患者中，也有1例发生了rrs突变（2.38%）。Eto耐药株3株，且均发生fabg1突变；40例Eto敏感株中也有1株（2.5%）发生fabg1突变。3株PAS耐药株中有1株发生folc突变；在40例PAS敏感菌株中，1例（2.5%）发生folc突变。WGS检测到12株PZA相关耐药基因突变pncA（27.9%，12/43），利奈唑胺（Lzd）、氯法齐明（Cfz）和贝达喹啉（Bdq）均未发现耐药相关的基因突变。最后，我们计算了WGS与pDST检测的一致性，发现RFB的pDST与其基因型DST（gDST）的一致性最低（67.2%），所有以MIC为参照的RFB敏感分离株均存在利福霉素耐药基因突变；Am、Km、Eto和RFP的gDST和pDST的一致性为97.7%，其次是Mfx（95.3%）、Lfx和PAS（均为93.0%）、Sm（90.3%） 、INH（86.0%）及EMB（79.1%）。

结    论

中国的初治MDR-MTB菌株具有一定的氟喹诺酮类药物耐药率，而对Lzd、Cfz、Bdq均未发现耐药依据。WGS在推断耐药谱方面具有一定的快速预测能力，且有可能通过单一检测确定大多数药物抗性。然而，pDST和gDST之间仍存在一些不一致，特别是在EMB、RFB和PAS中；pDST可与WGS互补以识别抗结核药物相关位点的非高度可信突变；WGS还可用于补充pDST易感性不太可靠的药物耐药性预测。

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供稿：孙雯雯

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2022-06-17

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