铁死亡——调节性细胞死亡 | MedChemExpress

多细胞生物中，调节性细胞死亡过程 (RCD) 是细胞维持组织形态和功能必不可少的稳态机制。此前研究较多的调节性细胞死亡包括三大类：细胞凋亡、自噬和坏死。

“铁死亡”这一概念最早在 2012 年由 Dr. Brent R Stockwell 提出，它是一种铁离子依赖的新型细胞调节性死亡，在细胞形态学上，生化特征区别于细胞凋亡、坏死、自噬。从机制上简单来说，铁死亡是细胞膜上铁依赖性的高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，诱导的细胞死亡。

近年来，铁死亡相关研究是如火如荼，前途一片光明。今年 1 月，广州医科大学唐道林教授团队在 Nat Rev Clin Oncol 上发表题为 Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer 的综述。

图 1. 铁死亡在癌症中的作用[1]

在这篇高分综述中，关于铁死亡，作者提出了几个观点：

1、铁死亡 (Ferroptosis) 是一种调节性的细胞死亡，依赖于铁介导的氧化损伤。

2、铁死亡可以通过两条主要途径：外源性 (转运蛋白依赖) 途径，内源性 (酶调控) 途径。

3、铁积累的增加，自由基的产生，脂肪酸供应与脂质过氧化物增加是诱导铁死亡的关键。

铁死亡的主要途径

■ 外源性 (转运蛋白依赖) 途径

外源性途径是通过抑制细胞膜转运蛋白如胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白 (System xc-)，或激活铁转运蛋白血清转铁蛋白和乳转铁蛋白启动的。

1、抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白来促进铁死亡

System xc- 是细胞内重要的抗氧化体系，该系统由 2 个亚基组成，SLC7A11 和 SLC3A2。SLC7A11 负责主要的转运活性，对胱氨酸和谷氨酸有高度特异性，而  SLC3A2 则作为伴侣蛋白。System xc- 以 1:1 的比例用胞内谷氨酸来换取胞外的胱氨酸 (Cys2)，胱氨酸在谷氨酸半胱氨酸连接酶 (GCL) 和谷胱甘肽合成酶 (GSS) 的催化作用下合成谷胱甘肽 (GSH)。

GSH 是膜脂修复酶——谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX4) 的还原性辅因子。抑制 System xc- 的活性会抑制胱氨酸的吸收，影响 GSH 的合成，继而导致膜脂修复酶 GPX4 活性降低，细胞抗氧化能力降低，从而促进铁死亡。

2、铁转运蛋白与铁 “超载”

增加铁的吸收，减少铁的储存和限制铁的外流都会导致铁积累增加，然后通过一系列的信号传导途径来促进铁死亡。

转铁蛋白 (血清转铁蛋白或乳铁蛋白) 通过转铁蛋白受体 (TFRC) 介导铁摄取，FTH1/FTL (铁蛋白组件) 通过自噬降解可以增加铁的水平，这些都可以促进铁死亡。而 SLC40A1 介导的铁外流和外泌体介导的铁蛋白输出会抑制铁死亡。

图 2. 铁死亡的分子机制[1]

(红色框：GSH-GPX4 抗氧化系统在铁死亡途径中起重要作用；蓝色框：铁积累与铁死亡；绿色框：脂肪酸积累与铁死亡调控；紫色框：甲羟戊酸 (MVA) 途径抑制 GPX4 的合成。)

■ 内源性 (酶调控) 途径

内源性途径是通过阻断细胞内抗氧化酶 (如 GPX4) 激活的。

1、抑制 GPX4 诱导铁死亡

脂质过氧化物积累是铁死亡的标志。GPX4 可将细胞毒性脂质过氧化物 (L-OOH) 还原为相应的醇 (L-OH)，抑制 GPX4 活性会导致细胞膜脂质过氧化物的积累。

直接抑制：如 RSL3 作为铁死亡诱导剂，可直接作用于 GPX4 并抑制其活性，因此降低了细胞的抗氧化能力并积累了 ROS，从而导致铁死亡。

间接抑制：前面提到的抑制 GSH 的合成；硒代半胱氨酸是 GPX4 活性基团的必需氨基酸之一，抑制甲羟戊酸途径可下调硒代半胱氨酸 tRNA 的成熟来影响  GPX4 的合成，从而影响 GPX4 的活性并诱导铁死亡。

2、其他酶的调节途径与脂肪酸积累

乙酰辅酶 A 羧化酶 (ACAC) 介导的脂肪酸合成，脂质吞噬 (Lipophagy) 介导的脂肪酸释放，可诱导细胞内游离脂肪酸的积累，促进铁死亡。

长链脂肪酸辅酶 A 连接酶 4 (ACSL4) 和溶血磷脂酰基转移酶 3 (LPCAT3) 促进多不饱和脂肪酸 (PUFA) 掺入磷脂中形成多不饱和脂肪酸的磷脂 (PUFA-PL)。PUFA-PLs 易受脂氧合酶 (ALOXs) 介导的自由基引发的氧化作用。这种氧化作用最终会导致脂质双层的破坏并影响膜功能，从而促进铁死亡。

铁死亡的研究策略

上文介绍了铁死亡的基本途径。铁死亡有哪些研究策略呢？下面以文献 Energy-stress-mediated AMPK activation inhibits ferroptosis 为例。

作者团队建立了特定病理过程 (铁死亡) 的细胞模型，使用多种诱导剂和抑制剂，以及多种检测方法证明铁死亡与 AMPK 的调控关系，并建立了 AMPKα1/α2 的基因敲除细胞系 (AMPK DKO)，验证 AMPK 缺失对铁死亡敏感性的作用机制。

■ 确立铁死亡病理模型

1、能量应激 (Energy stress) 抑制铁死亡

首先，研究人员探索了永生化小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) 中，葡萄糖饥饿条件对 Erastin 诱导的铁死亡的影响。首先，证明 Erastin 诱导铁死亡：Caspase-3 或 PARP 裂解均未下调 (细胞凋亡的标志)，而且铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 可以逆转 Erastin 诱导的细胞死亡。最初他们预想，葡萄糖饥饿的条件会增强  Erastin 诱导的铁死亡，结果恰恰相反：葡萄糖饥饿很大程度上逆转了 MEFs 中引起的铁死亡。

图 3. 能量应激抑制铁死亡

(a. Erastin 诱导 MEFs 铁死亡；b. 葡萄糖饥饿条件下 MEFs 应对铁死亡的变化；c-d. CCK8 法和脂质过氧化测定法检测不同能量应激条件下 MEFs 应对铁死亡的变化。)

作者团队进一步选择了其他可诱导或模拟能量应激的化合物，包括 2-脱氧葡萄糖 (2-DG)、阿卡地新 (AICAR)、A769662。这些化合物也显著抑制了由 Erastin 处理引起的脂质过氧化和铁死亡。综上所述，能量应激抑制了铁死亡。

2、AMPKα1/α2 的基因敲除细胞系建立

上述模拟或诱导能量应激的化合物均会激活 AMPK，那么 AMPK 是否参与能量应激介导的铁死亡抑制？MEFs 中，如图 4a-b，AMPK 双敲除 (DKO) 可以完全逆转诱导能量应激的化合物对 Erastin 诱导的铁死亡的抑制作用。

紧接着，如图 4c，作者又验证了一组细胞系中的基础 AMPK 激活状态 (p-AMPK Thr172 为激活标志) 与铁死亡 (SLC7A11 的表达水平) 相关性。并且如图 4c-d 所示，SLC7A11 高表达细胞相对于低表达细胞对铁死亡的抵抗力更高，值得注意的是，虽然在 SLC7A11 高表达细胞中 AMPK 激活状态与铁死亡的敏感性无关，但 SLC7A11 低表达细胞中 AMPK 的激活与铁死亡敏感性呈负相关。以上数据表明能量应激部分通过 AMPK 抑制了铁死亡。

图 4. 能量应激抑制铁死亡与 AMPK 相关

(a. AMPKα1/α2 双敲除细胞系的建立；b. 不同能量应激条件下 AMPK DKO 细胞对铁死亡的响应；c. 不同细胞系的 AMPK 激活与 SLC7A11 的基础表达水平；d. 通过 CCK8 法和脂质过氧化测定法检测，SLC7A11 表达与细胞对铁死亡的敏感度相关。)

3、AMPK 失活使癌细胞对铁死亡敏感

AMPK 在高基础 AMPK 磷酸化水平的癌细胞系中是否会促进铁死亡抗性？AMPK 抑制剂 Compound C 可下调 AMPK 的激活，如图 5a-b，Compound C 处理使 ACHN 细胞 (高基础 AMPK 磷酸化的抗铁碱化细胞系) 对 Erastin 或胱氨酸耗竭变敏感。透射电子显微镜 (TEM) 的结果也显示，ACHN 细胞中，Compound C 与 Erastin 或胱氨酸耗竭共同处理导致线粒体收缩，膜密度增加，但细胞核中没有明显的 DNA 片段化 (铁死亡的细胞特征形态特征)。这表明 AMPK 的抑制使癌细胞对铁死亡敏感。

图 5. Erastin 或胱氨酸耗竭条件下 ACHN 细胞对铁死亡的敏感性

(a-b. CCK8 法和脂质过氧化测定法检测，Erastin 或胱氨酸耗竭条件下 ACHN 细胞对铁死亡的敏感性；c. 透射电子显微镜 (TEM) 分析)

综上所述，能量应激对铁死亡的抑制作用，并且这种抑制作用部分是通过 AMPK 的激活实现的。

总结：

1、GSH-GPX4 抗氧化系统在铁死亡途径中起重要作用。脂质过氧化物增加，转铁蛋白等介导的铁的积累，以及细胞内游离脂肪酸的积累都可以诱导铁死亡。

2、Hyemin Lee 等人使用铁死亡通路相关的抑制剂/诱导剂，以及建立了 AMPK 敲除细胞系，证明铁死亡与 AMPK 之间的调节关系。

3、常见的检测铁死亡的实验方法：铁死亡相关细胞存活分析，如文中的 CCK8 法 (其他细胞活力检测方法还包括 MTT 法，台盼蓝染色等)。

4、除了细胞活力测定，脂质氧化水平的测定 (文中的 C11 BODIPY 581/591 染色)，GSH 测定，线粒体 ROS 测定，以及 GPX4 活性测定，电镜下线粒体的变化的监测，特异性靶标分子的分析 (WB、IHC、IF 等) 也是常用的检测手段。

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参考文献

1. Daolin Tang, Xin Chen, Rui Kang, Guido Kroemer. Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2021 Jan 29.

2. Hyemin Lee, et al. Energy-stress-mediated AMPK activation inhibits ferroptosis. Nat Cell Biol. 2020 Feb; 22(2): 225-234.

3. Jie Li, Feng Cao , He-Liang Yin, et al. Ferroptosis: past, present and future. Cell Death Dis. 2020 Feb 3;11(2):88.

4. Caicun Zhou, Xuefei Li, et al. Targeting ferroptosis for cancer therapy: exploring novel strategies from its mechanisms and role in cancers. Transl Lung Cancer Res. 2020 Aug;9(4):1569-1584.