精品文献｜深度解读干细胞三胚层分化能力的影响因素

关键词

细胞治疗；iPSC干细胞培养；三胚层分化；分化诱导；KSR/MEF 和E8培养基；1型糖尿病；胰腺祖细胞；心脏类器官；心脏发育；胚层相互作用；药物筛选和疾病建模；神经退行性疾病；神经元分化；全基因组图谱；细胞表型异质性；培养环境

有人说：“20世纪是药物治疗的时代，21世纪是细胞治疗的时代”。而干细胞则是细胞治疗时代的“核心”之一。从2007年，3位科学家以“利用胚胎干细胞把特定基因改性引入实验鼠的原理”获得“诺贝尔生理学或医学奖”，到 2012年日本山中伸弥博士因“发现成熟细胞可以被重新编程诱导成为多能干细胞”再次斩获“诺贝尔生理学或医学奖” 。

干细胞作为一种具有自我更新和多向分化能力的细胞，是医学研究上用来 研究组织和器官再生、药物筛选，调控细胞命运转换以及动物发育分子机制的良 好模型。

iPSC在多种细胞因子相互作用下，可分化形成内、中、外3个胚层。进而可以体外模拟人胚发育，构建模拟标准化的人体细胞、组织和器官。 下面，我们就从近年发布的高分文章中对于 “iPSC三胚层的分化能力” 一 窥究竟！

内胚层

iPSC向 内胚层的分化是定向分化为相应器官细胞类型的第一步，也是作为验证iPSC多向分化潜能的一个重要指标。

糖尿病是一种严重威胁患者健康的慢性疾病，一直缺乏有效的治愈手段。而 干细胞治疗则被认为在治疗1型糖尿病中具有极大地应用前景。近年关于使用iPSC衍生的功能性β细胞研究取得了显著的进展。其基本策略 是重演了胚胎时期多能干细胞分化的主要路径：形成明确的内胚层，然后胰腺内胚层，再到内分泌前体细胞（祖细胞）并最终形成胰岛细胞 。

而 如何精准诱导iPSC向内胚层分化 是其中至关重要的一步。

在一项iPSC衍生的胰腺祖细胞研究中 ，作者从文献中选择了5种方法 在 Essential 8 培养基或KSR/MEF培养基中诱导PSC定向分化为内胚层 ， 并进一步采用6种方案评估其分化为胰腺祖细胞的能力。为了评估体外内胚层定向分化的能力。研究人员使用流式细胞术对CD117 和 CXCR4这两个内胚层分化表面标志物进行了检测。同时，作者对比了KSR/MEF 和E8培养基 在分化效率的区 别。结果表明 在DE4和DE5的培养方案下KSR/MEF培养效果较差， 细胞几乎完全死亡。而在DE1-3方案中， 两者效果相近。这表明 不同的培养基条件，对于干细胞的诱导分化具有重要影响 ，尤其是在内胚层这样的关键分化步骤中。

Fig.1 PSC differentiation to definitive endoderm

进一步地，研究人员又比较了KSR/MEF 或 E8 培养基中 PSC 从 内胚层 分化到表达PDX1细胞的能力（PDX1 控制胰腺的胚胎期发育，存在于正常成熟胰腺的β细胞中）。通过 流式细胞术检测表明使用 方案5和6中E8培养基诱导细胞分化的效率更高。而KSR/MEF培养基在各个方案中变异系数较大。 因此为了保持研究结果的稳定性，研究人员仅采用了E8培养基用于后续的研究。

Fig.2 Differentiation from DE to PDX1+ presumptive pancreatic endoderm.

综上，在这篇文章中，研究人员对从不同PSC细胞分化为胰腺祖细胞的实验方案和条件进行了比较分析，并从中确定了一个最佳培养方案和条件。为1型糖尿病的干细胞治疗提供了参考。

中胚层

心脏病可能是我们日常听过最多的医学名词之一。心脏作为第一个在发育过程中形成的功能性器官，也是最难在体外建立模型的器官之一。目前通过一些动物以及细胞模型的研究工作，科学家们对于心脏谱系在胚胎中胚层中的命运决定方式已经有了一定认识，主要包括心肌细胞（Cardiomyocy tes，CMs）、心内膜细胞（Endocardial cells， ECs）以及心外膜细胞（Epicardial cells）。

干细胞的横空出世给心脏模型体外研究提供了契机。 如何利用干细胞进行体外心脏模拟发育过程各个方面成为近年研究热点。

Nature Biotechnology 在2021年发表了一篇题为《Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development》的研究性文章。在文中，研究人员 构建了一个高度结构化的复杂三维心脏形成类器官 (HFO)，为研究早期心脏 发育提供了新的研究方案。

近年来关于使用干细胞构建心脏类器官的研究曾出不穷，然而这些研究并未涉及早期心脏发育的时空模式，包括与前肠内胚层的相互作用。因此，在这项研究中，研究人员在体外开发一套人类早期心脏发生模型的稳定方法，并将该模型用于体外检测基因敲除研究。

在这篇研究中，研究人员 首先将人PSC预铺在Geltrex包被板上，然后在形成 HFO 之前转移至E8培养基中进行培养。通过14天培养，研究人员获得了直径约 2 mm 的类器官。 随后，通过对HFO进行荧光显微镜和激光扫描光学断层成像，研究人员确定了HFO的径向对称性生长特性，进 一步地免疫荧光实验证实了HFO的结构特点： 被密集的心肌层包围 ，并被松散排列的心肌细胞和横隔样细胞覆盖，最终被间充质细胞包围。

Fig.3 HFOs recapitulate pns of early cardiomyogenesis.

此外，研究人员又使用 CD31 染色对HFO内血管样结构和心内膜样细胞的形成过程进行了鉴定。透射电镜进一步确定了HFO 内血管的结构形成特征。随后，研究人员又通过组织学方法对HFO内SOX17、SOX2 和 HNF4α 的差异表达进行了分析，揭示了不同的前肠内胚层组织分化； 同时使用scRNA-seq对不同时期的前后内胚层表达模式进行了分析 。最后，体外测试了 HFO 对NKX2.5 -KO 表型建模方面的适用性。

综上，研究人员开发了一种相对简单、快速且稳定 的HFO技术方案，并且该方案在未来研究中有望用于高通量的药物筛选和疾病建模，为研究心 脏早期发育和疾病模型提供了新策略。

外胚层

随着神经退行性疾病的日益增多，临床上目前仍然缺乏疗效确切的治疗药物，以致神经退行性疾病至今仍无法达到令人满意的治疗效果。 而 干细胞疗法则为神经退行性疾病的治疗提供了新途径。

Fig.4 Gene expression variability in IPSDSNs is influenced by differentiation conditions.

在 Nature Genetics 的一篇文章《Molecular and functional variation in iPSC-derived sensory neurons》中，研究人员 比较了饲养层系统培养的iPSC (feeder iPSCs)和无饲养层系统培养的iPSC (E8 iPSCs)在基因表达图谱上的巨大差异。

Fig.5 Characterization of molecular phenotypes in iPSC-derived sensory neurons.

在这项研究中，研究人员使用107个来自无关的、明显健康的个体的iPSC 谱系进行了 123次分化，在经过质控后，研究人员获得了119个iPSC的差异表达样本，并对其中106个P2样本进行了分析（QTL除外）。

Fig.6  A heat map of RNA-seq data for ten marker genes of the two cell clusters identified by SC3

随后，为了减少研究误差，研究人员又使用scRNA-seq对来自同一个体的 177 个 IPSDSN 进行了测序。结果发现IPSDSN与DRG在全基因组表达方面具有较大的相似性。

由于使用iPSC 开展遗传研究的一个核心问题是细胞表型的异质性。这种异质性可能源于供体遗传背景、克隆选择的影响以及重编程和分化过程中细胞培养环境的影响。因此，研究人员又对IPSDSN基因表达的异质性进行了分析，结果表明IPSSSNs 中神经元基因的表达存在较大异质性，这可能是分化变异的结果。

为了进一步探究异质性存在的原因，研究人员 对iPSC培养条件进行了比较分析，结果发现神经细胞受分化前的iPSC培养条件的影响。在E8培养基中 iPSCs 分化出的神经元含量更高。 同时，研究人员使用RASQUAL和ATAC-seq等方法还发现遗传变异还能够影响感觉神经元的基因表达、剪接和染色质可及性。

综上，这项研究让我们看到了iPSC分化神经元在不同培养基中基因表达差异的巨大变化，尤其是与神经系统发育相关的基因，为我们开展相关研究提供了一个参考。

总结

干细胞之所以被称为“万能细胞”，这依赖于干细胞的多向分化机制，干细胞拥有分化成为任何一个细胞的能力，通过分化成不同的细胞，继而可以组成各类器官和组织。而干细胞的胚层分化能力则是多向分化机制的第一步。

从本文中我们可以发现 选择合适的培养体系和培养基对干细胞三胚层的分化影响重大。 而 从 大量发表的高质量文献中我们可以看到Essential 8 iPS细胞培养基体系和配套试剂为多能干细胞提供了成分最明确、一致性最好的培养条件 ，可以成为我们做干细胞研究的首选。

hPSC相关的基础研究和再生医学应用越来越受重视，hPSC的高质量维持培养是得到有效实验结果和新发现的前提。可以看到，Essential 8无饲养层培养基深受这些优秀科学家的喜爱，被广泛应用于类器官，iPSC疾病模型，药物发现等前沿研究中。 赛默飞Es sential 8 培养基已用于支持 PSC 生长超过50 代，未出现核型异常的迹象，同时保持 PSC 分化为所有三种生殖谱系的能力 。

PSC标记染色一Nanog、Tra-1-60和Sox2染色Essential 8培养基中培养的PSC,在玻连蛋白 包被 的孔板上传至第50代。

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三系分化—对 Essential8 培养基，rhVTN-N包被板培养的 PSC培养物进行外胚层（βIII 微管蛋白，TUJ1）、中胚层（平滑肌肌动蛋白，SMA）和内胚层（甲胎蛋白，AFP）类胚体染色，复染 DAPI（蓝色）。

参考文献：

1.Rostovskaya.etal."Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells."Philosophical Transactions of the Royal Society B：Biological Sciences 370.1680（2015）：20140365.

2.Drakhlis.et al."Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development."Nature Biotechnology 39.6（2021）：737-746.

3.Oksanen.et al."PSEN1 mutant iPSC-derived model reveals severe astrocyte pathology in Alzheimer's disease."Stem cell reports 9.6（2017）：1885-1897.

4.Thermo Fisher Scientific 多能干细胞实验方案手册.

5.Essential 8 细胞培养基体系：Gibco Essential 8 细胞培养基基于最原始的配方，是成分明确、一致性高的无滋养层培养基，用于培养诱导多能干细胞（iPSC）。它已针对多种应用进行了优化，可帮助研究人员实现对其PSC培养体系的极致控制效果。