【中西合璧】电针预处理通过激活α7-nAChR信号改善老年大鼠术后认知功能障碍

上海中医药大学附属岳阳医院麻醉科

背景

术后认知功能障碍(POCD)涉及专注力、注意力或记忆障碍，是麻醉和手术后的常见并发症，常与死亡率增加相关。现如今，随着老龄化的不断增加，POCD作为一种与年龄相关的围手术期并发症已成为影响家庭和社会的世界性问题。迄今为止，POCD的发病机制仍不清楚，目前还缺乏预防和治疗POCD的有效手段。以往的研究表明，麻醉及手术引起的应激反应会导致中枢神经系统的炎症反应。据报道，包括异氟醚和七氟醚在内的吸入麻醉剂可诱导海马体发生炎症反应，进而导致老年大鼠的认知功能障碍。此外，对小鼠行手术及机械通气，会进一步导致慢性神经炎症并加重认知障碍。

针刺是一种传统的中医治疗技术，被认为可以恢复体内平衡并具有抗炎作用。近年来，电针（EA）对POCD啮齿动物模型的认知功能障碍具有预防作用。电针可改善局灶性腔隙性梗死的老年患者的认知能力；然而，电针对老年人POCD的潜在作用机制仍有待明确。据报道，EA可激发抗炎胆碱能依赖性信号，即α7-烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)，可能对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用。此外，α7-nAChR的激活通过抑制高迁移率族蛋白B1(HMGB1)-核因子-κB(NF-κB)通路来改善放射性肺损伤和酵母聚糖诱导的急性肾损伤。EA通过抑制脊髓中的HMGB1/NF-κB信号来改善神经病理性疼痛。HMGB1是大脑中丰富的炎性蛋白，可能参与认知衰退相关疾病的发病机制。NF-κB作为HMGB1的下游信号，可诱导多种炎症因子。目前，α7-nAChR和HMGB1-NF-κB在EA对术后POCD的作用尚不清楚。

这项研究确定了EA预处理是否可以改善啮齿动物胫骨骨折手术模型中的POCD。同时进一步研究了α7-nAChR和HMGB1-NF-κB信号在POCD中的作用。该研究成果发表在Neuropsychiatric Disease and Treatment杂志上，中西合璧专栏对该文献进行了编译，以飨读者。

示意图

方法

所有涉及动物的实验均根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行。涉及动物的协议也得到了河北医科大学动物审查委员会的批准。

组别分配

基于计算机的随机化,将雄性SD大鼠随机分配到以下五组之一：

（1）空白对照组；

（2）POCD；

（3）EA+POCD；

（4）α-银环蛇毒素（α-BGT）+EA+POCD；

（5）α-BGT+POCD。

除对照组外，2、3、4、5组均行胫骨骨折手术。EA预处理组（第3组和第4组）每天进行一次EA预处理，持续5天，并于最后一次EA预处理后24小时进行胫骨骨折手术。α-银环蛇毒素相关组在每次电针预处理前30分钟通过腹膜内注射给药(α-银环蛇毒素)。注：α-银环蛇毒素是一种特异性α7-nAChR拮抗剂。通过腹膜内注射氯化钠作为对照治疗(图1A)。

图1(A)实验示意图。

POCD模型

雄性SD大鼠用于建立胫骨骨折手术后的POCD模型。在手术治疗之前，将鼠关在单独的笼子里，笼子里装有刨花，温度为20-22°C，昼夜交替12小时，并允许随意饮水和进食。将大鼠放在装有七氟烷的麻醉箱中，然后放置在加热垫上。剃毛消毒后，在左后爪做正中切口，剥离胫骨骨膜。胫骨截骨术后，将针插入髓内管，并用丝线缝合伤口。空白对照组（第1组）大鼠仅在麻醉后对左后爪进行皮肤切开和缝合。

电针预处理

使用电子针刺治疗仪（型号G6805；SMIF，中国上海）进行电针治疗。七氟醚麻醉后，以2-15Hz的频率在合谷(LI4)、内关(PC6)和足三里穴位(ST36)进行电针预处理。同时，EA刺激强度处于中度肌肉收缩水平。LI4位于第一、二掌骨之间，PC6位于距腕横纹约3毫米处，ST36位于胫骨前结节外侧约5毫米处（图1B）。空白对照组（第1组）和POCD组（第二组）的大鼠接受针刺，但未受到电刺激。   

图1(B)分别在合谷(LI4)、内关(PC6)和足三里穴位(ST36)进行电针预处理

统计分析

数据表示为平均值±标准差。所有统计分析均使用SPSS软件进行。对于具有正态分布的数据，进行单因素方差分析以评估差异，然后进行Tukey的多重比较测试。对于非正态分布，进行Kruskal-Wallis检验以评估差异，然后进行Dunn-Bonferroni检验。双向重复测量方差分析和Tukey的事后测试用于分析训练期间的逃避潜伏期。统计学显著性被确定为P<0.05。

结果

电针预处理可减轻老年大鼠的POCD。

因为老鼠天生就有探索新物体的倾向，所以新物体识别（NOR）被用来判断认知和记忆。在熟悉阶段，五组在左右相同对象之间花费的总时间没有显著差异（图2B）。在试验阶段，接受胫骨骨折手术治疗的大鼠（第2、3、4、5）组与用空白对照组（第1组）相比，根据时间测量计算的RI降低（P<0.0001；图2A和C）；然而，与POCD组相比，EA预处理显著增加了EA+POCD组的RI（P<0.05；图2A和C），而α-BGT部分逆转了这种增加（P<0.01；图2A和C）。POCD、EA+POCD和α-BGT+POCD组中老年大鼠的RI没有差异（图2A和C）。此外，上述五组大鼠之间的总距离和平均速度没有显著差异（图2D和E）。为了进一步检查老年大鼠的学习和记忆，在NOR测试后进行了莫里斯水迷宫测试。5组大鼠第1天逃逸潜伏期无显著差异，但术后2-4天开始，POCD组接受胫骨骨折手术大鼠潜伏期较空白对照组（第1组）大鼠更长（P<0.05；图2F和G)。术前的EA预处理显著缩短了术后2-4天POCD组定位平台的潜伏期（P<0.05；图2F和G）；然而，在术后第2-4天，与EA+POCD处理的大鼠相比，发现经α-BGT+EA+POCD处理的大鼠潜伏期增加（P<0.05；图2F和G）。此外，与空白对照组大鼠相比，POCD组在跨平台次数（P<0.0001），总时间（P<0.001），以及在目标象限中运动的距离(P<0.0001)均显著降低(图2I-K)。还发现，与POCD组相比，EA预处理显著增加了跨平台次数(P<0.01)、总时间(P<0.01)和在目标象限中运动的距离(P<0.001)(P<0.05;图2I-K)，而α-BGT部分逆转这些变化（P<0.01；图2I-K）。α-BGT+EA+POCD组和α-BGT+POCD组老年大鼠在定位淹没平台的潜伏期、跨平台次数、总时间和在目标象限中运动的距离无明显差异（图2I-K)。此外，上述五组大鼠的平均游泳速度无显著差异（图2H）。

图2电针预处理减轻老年大鼠的POCD。

电针预处理可改善老年大鼠术后的神经元损伤

通过Nissl染色和TUNEL测定评估神经元数量和细胞凋亡。数据显示术前神经元排列整齐，齿状回结构完整，但手术后神经元杂乱无章。EA预处理显著恢复了齿状回的排列和结构，而α-BGT部分逆转了EA的保护作用。此外，与空白对照组相比，POCD组的Nissl小体显著减少（P<0.0001），但TUNEL阳性神经元增加（P<0.001）（与空白对照组相比；图3A-D）。然而，与POCD组相比，EA预处理恢复了神经元数量（P<0.01），但EA+POCD组的减少了TUNEL阳性神经元（P<0.001）（EA+POCD与POCD组，P<0.05；图3A-D），而α-BGT部分逆转了这些作用（Nissl，P<0.05；TUNEL，P<0.0001；α-BGT+EA+POCD与EA+POCD组；图3A-D）。α-BGT+EA+POCD组和α-BGT+POCD组老年大鼠的神经元数量和凋亡无明显差别。   

图3电针预处理可改善老年大鼠术后的神经元损伤。

电针预处理改善老年大鼠术后小胶质细胞活化

使用Sholl分析来分析齿状回中的Iba1阳性细胞。根据细胞胞体的扩张和细胞分支的缩短作为细胞活化的形态学证据。与空白对照组相比，行胫骨骨折手术的大鼠活化的小胶质细胞数量（Iba1阳性细胞数）（P<0.0001）和分支长度（P<0.0001）显著增加(图4A-C)。请注意，与POCD组相比，EA预处理显著减少了活化小胶质细胞的数量（P<0.0001）；EA+POCD组与POCD组相比（P<0.0001；图4A-C），小胶质细胞恢复了分支长度（P<0.0001），而α-BGT部分逆转了活化小胶质细胞的这些变化（P<0.0001；图4A-C）。此外，α-BGT+EA+POCD组和α-  BGT+POCD组中，老年大鼠之间的活化小胶质细胞没有差异。

图4电针预处理改善老年大鼠术后小胶质细胞活化。

电针预处理可改善小胶质细胞中HMGB1和Phosphor-NF-κB的表达

使用免疫荧光法检测小胶质细胞中HMGB1和Phosphor-NF-κB，它们是神经炎症因子的重要调节因子。结果表明，与空白对照组大鼠相比，接受手术治疗后的老年大鼠HMGB1(P<0.0001)和磷酸-NF-κB阳性(P<0.0001)小胶质细胞的百分比显著增加（图5A-D）。与POCD组相比，EA预处理显著降低了EA+POCD组中HMGB1联合Iba1阳性细胞（P<0.0001）和Phosphor-NF-κB联合Iba1阳性细胞（P<0.0001）（图5A-D）；然而，与EA+POCD组相比，α-BGT给药显著降低了α-BGT+EA+POCD组中HMGB1（P<0.0001）和Phosphor-NF-κB阳性（P<0.0001）小胶质细胞的百分比（图5A-D)。此外，α-BGT+EA+POCD组和α-BGT+POCD组，老年大鼠之间HMGB1-和Phosphor-  NF-κB阳性小胶质细胞的百分比没有差异。

图5电针预处理改善小胶质细胞中HMGB1和磷酸-NF-κB的表达。

电针预处理改善老年大鼠术后HMGB1下游因子的表达

此外，使用蛋白质印迹评估了HMGB1下游炎症因子，包括海马中的NF-κB、IL-6和IL-1β。对空白对照组和POCD组的大鼠蛋白质印迹检测结果显示，大鼠胫骨骨折手术后Phosphor-NF-κB（P<0.001）、IL-6（P<0.0001）和IL-1β（P<0.05）的表达均显著升高（图6A-D）。与POCD组大鼠相比，EA+POCD组大鼠Phosphor-NF-κB（P<0.001）、IL-6（P<0.0001）和IL-1β(P<0.05)(图6A-D)表达显著降低。同样，这些变化中的每一个（Phosphor-NF-κB，P<0.001；IL-6，P<0.0001；IL-1β，P<0.05）都被a-BGT逆转（图6A-D）。此外，α-BGT+EA+POCD组和α-BGT+POCD组老年大鼠海马Phosphor-NF-κB、IL-6和IL-1β的表达没有差异。

图6电针预处理改善老年大鼠术后HMGB1下游因子的表达。

结论

目前的研究结果表明，EA预处理通过激活α7-nAChR改善胫骨骨折术后认知功能障碍。EA诱导的α7-nAChR的激活显著增加了跨平台的次数并提高了新型目标识别时间，恢复了神经元的数量，减少了TUNEL阳性神经元，减轻了小胶质细胞的活化，下调了小胶质细胞中HMGB1和NF-κB的表达，降低了HMGB1相关下游因子的水平，包括NF-κB、IL-6和IL-1β，而α-BGT部分逆转了这些变化。总体而言，这项研究强调了α7-nAChR信号在POCD条件下调节神经炎症反应中的关键作用。

本研究确定了EA预处理的改善POCD作用和确切机制。EA预处理改善了术后老年大鼠的认知功能障碍，其机制可能与激活海马中α7-nAChR信号从而抑制HMGB-1-NF-κB有关。

中西合璧述评

前期临床试验在麻醉和/或手术后认知功能变化的机制方面有很多见解，并且有一些令人信服的假设：与神经炎症、炎症消退和不良麻醉作用相关。然而，围手术期神经认知功能障碍与手术或麻醉剂之间的关系尚不确定。小胶质细胞激活诱导的炎症级联反应导致重要细胞核的微环境发生显著变化，从而导致神经元变性。促炎细胞因子，包括小胶质细胞分泌的IL-6和IL-1β可导致缺血或感染模型中的神经元损伤和凋亡。HMGB1-NF-κB信号的激活参与炎性细胞因子的上调。目前的研究表明，在胫骨骨折后，小胶质细胞通过分支增加和胞体增大的方式，其活性显著增加。研究还发现小胶质细胞中的HMGB1-NF-κB信号以及HMGB1下游因子（包括齿状回中的IL-6和IL-1β）的表达升高。这些数据表明，小胶质细胞中HMGB1-NF-κB信号的激活可能与术后认知功能障碍的发展有关。

根据中医理论，合谷是大肠经的起点，通常用于治疗头面部的各种疾病。内关对神经功能障碍具有潜在的治疗作用。此外，足三里是“胃经”的主要穴位，可促进神经系统疾病的恢复。在目前的研究中，发现在老年大鼠中用合谷、内关和足三里进行电针预处理也显著增加了莫里斯水迷宫试验中跨平台的次数，并在胫骨骨折手术模型中提高了新型目标识别时间。此外，EA预处理还恢复了神经元数量，抑制了小胶质细胞的活化，减少了POCD模型中HMGB1和NF-κB阳性小胶质细胞的数量。上述数据表明，EA预处理抗POCD的机制可能与抑制小胶质细胞中HMGB1-NF-κB信号有关。

α7-nAChR是一种胆碱能依赖性信号，可参与多种神经系统疾病，包括帕金森病、阿尔茨海默病和情绪变化。当α7-nAChR信号被阻断时，术后小鼠的认知功能，包括探索、记忆和学习，可能会明显变差。研究发现α-BGT（α7-nAChR的选择性拮抗剂）可部分逆转EA预处理对胫骨骨折手术后认知功能障碍的神经保护作用。慢性应激后，小胶质细胞中α7-nAChR的表达显著降低。此外，α7-nAChR在胆碱能抗炎途径中发挥重要作用，该途径在炎症中调节巨噬细胞/小胶质细胞功能。以往的研究和本次研究结果均表明，小胶质细胞中的α7-nAChR可能是术后认知功能障碍的上游信号通路。此外，小胶质细胞的活化会导致老年大鼠在围手术期应激后发生脑组织炎症和认知功能障碍，而α7-nAChR可能介导了齿状回中小胶质细胞活性的降低。

当前研究存在几个局限性。首先，此只进行了一种POCD模型。老年大鼠的其他POCD模型，例如脾切除术和部分肝切除术，应进一步研究。此外，不仅是合谷、内关、足三里，其他穴位也要研究。因此，需要更多的努力来进一步探索EA预处理对POCD的潜在机制。

译稿：严兆霞 述评：许华 

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