【文献学习】儿童胶质母细胞瘤预后相关的分子病理学分析

研究背景

胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）是最常见的原发性恶性脑肿瘤，预后极差，只有不到5%的患者在确诊后存活超过5年。目前的治疗策略是手术最大切除肿瘤，术后行替莫唑胺同步放射治疗和替莫唑胺维持治疗。GBM的发病率随年龄增长而增加，约占成人恶性脑肿瘤的一半，但只占儿童中枢神经系统肿瘤的10 ~15%。尽管儿童和成人GBM具有相似的组织病理学表现和相似的临床预后，但目前已经发现，儿童与成人GBM具有不同的基因组和表观基因组结构。

虽然已经提出了许多针对成人GBM的分子预后标志物（如MGMG甲基化率等），但对于儿童GBM的预后因素目前还没有得到精确阐述。但是，目前，由于相对较小的队列规模和/或应用治疗方式的异质性，关于儿童GBM的突变、基因表达模式和拷贝数变异的预后价值的研究结果往往不一致或相互矛盾。此外，鉴于这些肿瘤广泛的生物异质性，迫切需要具有代表性的大规模的研究。

本研究通过对202例经手术和放化疗后儿童GBM进行综合分子分析，研究了基因组和表观遗传学改变的预后意义，并确定了一组用于儿童GBM临床预后分层的可靠的标志物。

研究方法

1、患者人群

组织样本来自202例年龄1~ 18岁、组织学诊断为“胶质母细胞瘤，WHO IV级”的儿童患者。组织学诊断基于当时WHO关于GBM的标准（2007版）。

中位年龄为12岁，中位随访时间16个月。在开始进行这项分析时，133例患者（66%）已经死亡。大多数患者在1998年至2013年期间在莫斯科Burdenko神经外科研究所接受过治疗。

根据影像学结果及术中资料显示，超过一半的肿瘤位于大脑半球（112，55%），其中，83例（41%）肿瘤位于丘脑/基底节区，7例（3%）肿瘤位于脑桥/脑干（即DIPG）。年龄>3岁的患者（n = 187）接受手术治疗（肿瘤全切或次全切除），然后接受放疗及替莫唑胺辅助化疗。15例年龄<3岁的患者，在手术治疗后仅接受辅助化疗。另外15例≤3岁患者术后仅接受化疗。

2、分子分析

本试验中对组织样本进行的分子分析包括以下内容：DNA甲基化水平，MGMT启动子甲基化状态，组蛋白突变[H3F3A (H3.3)、HIST1H3B、HIST1H3C (H3.1)]，以及其他相关基因突变或扩增[IDH1、BRAF、EGFR、MYC、MYCN、PDGFRA、CDK4、MET、CDK6、CCND1和CCND2]。

研究结果

1、分子分型

对组织样本进行全基因组DNA甲基化检测，分层聚类分析显示，在整个患者队列中有四个肿瘤亚群，其中3个分别具有H3.3 G34突变、H3.3/H3.1 K27突变和IDH1突变。然而，不具备上述3种突变的亚群，其甲基化图谱显示出更大程度的异质性（图1）。

图1. 202例肿瘤的DNA甲基化聚类分析

鉴于此，作者重新分析了H3/IDH野生型（wt）肿瘤亚群，以确定潜在的其他亚组。考虑到该队列中一些患者获得了长期生存和广泛的儿童胶质瘤组织学谱，将该亚群的DNA甲基化结果与10例低级别胶质瘤（LGG，即毛细胞星形细胞瘤）和10例多形性黄色星形细胞瘤（PXA）以及12例正常脑样本进行比较。结果显示，在组织学表现为GBM的肿瘤中，有相当一部分的DNA甲基化模式与LGG（13，6%）或PXA（27，13%）更为相似。而一位经验丰富的神经病理学家对其中18例肿瘤进行了盲法检查，确证15例患者组织学表现为GBM，仅3例肿瘤具有LGG或PXA特征。

DNA甲基化模式类似于低或中等级别的肿瘤通常发生在年轻患者（中位年龄为7岁vs. 12岁，p=0.0005），15例3岁以下患者中有10例属于上述两个低级别亚组。

与其他样本相比，在这两个低级别亚组中观察到的其他基因组改变也很明显。在LGG样亚组中，4/13（31%）的肿瘤具有BRAF V600E突变，未检测到局部癌基因扩增，无染色体9p21上CDKN2A/B位点缺失；PXA样亚组中，13/27（48%）肿瘤具有BRAF V600E突变，8/27（30%）肿瘤9p21纯合缺失，3例同时存在上述两种突变。而在其他亚组中，162例样本中只有4例（2%）具有BRAF V600E突变。

重要的是，显示分子级别较低特征的肿瘤比具有分子级别较高特征的肿瘤预后更佳，LGG样亚组肿瘤的3年总生存率（OS）为91%，PXA样亚组肿瘤的3年OS为70%，其他亚组的3年OS约为20%（图2）。

图2. LGG样亚组和PXA样亚组与其他亚组的生存情况

进一步分析162例GBM亚组的样本，分布如下：H3.3 G34突变（n = 24，15%）， H3.3/H3.1 K27突变（n = 69，43%），IDH1突变（n = 10，6%），以及H3/IDH 野生型（n = 59，36%）。通过对H3F3A、HIST1H3B/HIST1H3C和IDH1的直接测序，所有病例均证实了DNA甲基化亚组的预测突变，G34、K27 和IDH1突变肿瘤仅分布于相应的甲基化亚群。

84例（52%）具有一个或多个癌基因扩增，不同分子亚型中基因扩增类型不同（表1）。最常见的扩增基因是PDGFRA （30/162，19%），其次是EGFR（26/ 162，16%）和MYCN（17/ 162，10%）。除基因扩增外，还检测了CDKN2A/B位点和染色体10q的缺失。9p21纯合缺失仅在25例（15%）肿瘤中发现，在IDH1突变亚组中更常见（6/10，60%），但在K27肿瘤中非常罕见（1/ 69，1%）。在42%的儿童GBM（68/162）中发现10q杂合子缺失，并且散在分布在所有分子亚型中。

表1. 最初诊断为GBM的202例儿童胶质瘤的临床分子分型

MGMT启动子甲基化在40/162（25%）的儿童GBM中被发现，在不同分子亚组中有显著的差异性：在IDH1突变亚组（90%）和H3.3 G34突变亚组（75%）中最常见，偶尔在H3/IDH 野生型中发现（19%），在H3K27突变亚组中罕见（3%）。

儿童GBM不同亚组在中枢神经系统中的部位不同。H3K27突变亚组肿瘤几乎完全位于中线结构（丘脑和脑干，只有一个例外），而其他亚组几乎完全出现在大脑半球，除了在基底节区或脑桥检测到的H3/IDH野生型的一小部分。超过一半的H3K27突变亚组在治疗后发生播散，而其他亚组的颅内-脊髓转移率要低得多。

2、预后分析

儿童GBM亚组和其他临床或分子病理改变与患者预后显示出了一定的相关性（图3）。与其他亚组相比，IDH1突变亚组生存期显著长久，而H3K27突变亚组预后最差，G34突变亚组较野生型生存期有延长趋势，但没有统计学差异。

图3. 162例儿童GBM不同分子亚组的生存比较

对各种临床和分子特征的单因素生存分析显示：肿瘤位于中线位置、H3K27突变和致癌基因扩增均提示预后较差，而男性、G34或IDH1突变、9p21缺失和MGMT启动子甲基化与更有利的临床预后相关（表2）。多因素分析发现，在整个儿童GBM队列中，癌基因扩增和H3K27突变是重要的预后不良的独立预后标志物，而IDH1突变是生存期延长的独立的有利预后标志物（表2）。

表2. 单因素及多因素分析各个变量与预后的相关性

在特定的GBM亚组中，一些变量也被发现与预后显著相关。对于G34突变型肿瘤，男性预后明显较好，而致癌基因扩增与不良预后相关。在H3K27或IDH1亚组中，未检测到任何临床或分子因素与预后显著相关。

上述分析促使作者提出了一个基于H3K27突变或癌基因扩增的儿童GBM风险分层的模型：即具有癌基因扩增的肿瘤，或具有H3K27突变的肿瘤将被视为高危组，而缺乏这些标志物的肿瘤可能被视为中危组。高危组（n=124）和中危组（n=38）的3年总生存率分别为5%和72%，提示该风险分层具有潜在的临床应用价值（图4）。

图4. 不同风险分层的生存情况

对两种风险组患者特征进一步分析发现，中危组患者通常具备的特征有：男性患者、病灶位于大脑半球、具备G34/IDH1突变和MGMT甲基化。在高危组，90%患者在肿瘤复发时出现了播散（表3）。

表3. 儿童GBM不同风险分层的临床和分子特征

研究结论

• 1. 组织学证实为胶质母细胞瘤的儿童患者中， 一部分（20%）在分子学上表现为低级别或多形性黄色星形细胞瘤，且预后良好。

• 2. 根据H3 G34突变、H3K27突变、IDH1突变的情况，可以将儿童胶质母细胞瘤划分为4个亚组，这些亚组与特定的细胞遗传学改变、MGMT甲基化模式和临床预后相关。

• 3. 根据癌基因扩增和/或H3K27突变将儿童胶质母细胞瘤划分为高危组和中危组，这两个风险分层可以指导临床治疗选择。

参考文献：Korshunov A, Ryzhova M, Hovestadt V, et al. Integrated analysis of pediatric glioblastoma reveals a subset of biologically favorable tumors with associated molecular prognostic markers. Acta Neuropathol. 2015;129(5):669-678.

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编译：李寓安

审校：张俊平

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