纳米卟啉和双量子点的荧光生物传感器于多耐药结核分枝杆菌的检测

近日，Analytical Chemistry 期刊发表了一篇文章：

Fluorescence Biosensor for One-Step Simultaneous Detection of Mycobacterium tuberculosis Multidrug-Resistant Genes Using nanoCoTPyP and Double Quantum Dots. Hu O，Li Z，He Q，Tong Y，Tan Y，Chen Z. Anal Chem，2022，94(22): 7918-7927. doi: 10.1021/acs.analchem.2c00723. PMID: 35594337。中山大学药学院胡鸥博士为文章的第一作者，通讯作者是广东省第二人民医院童艳丽副主任药师、广州胸科医院谭耀驹主任医师和中山大学陈缵光教授。

01背景

多耐药结核病的出现增加了结核病治疗的难度。利福平(RFP)和异烟肼(INH)是一线抗结核的两种最有效药物，同时对这两种药物耐药被认为是耐多药结核病。目前MDR-TB的鉴定方法主要包括药物敏感性试验(DST)和Xpert MTB/RIF(Xpert)试验。但DST方法耗时长，Xpert方法则主要用于检测Mtb和RFP耐药性。因此，仍需研究快速、经济和灵敏的耐多药结核病的诊断方法。本研究构建了一种新型、低成本的基于纳米卟啉nanoCoTPyP和双量子点（QDs）的荧光传感方法，用于一步同时检测Mtb耐多药基因（利福平耐药：rpoB基因的第531位，异烟肼耐药：katG基因的第315位）。检测原理如图1所示，QDs1和QDs2分别与ssDNA1和ssDNA2连接构建QDs1-ssDNA1和QDs2-ssDNA2探针，它们可以吸附到nanoCoTPyP上，由于荧光共振能量转移和光诱导电子转移，导致量子点荧光猝灭。在目标DNA存在的情况下，目标DNA与ssDNA杂交形成更稳定的双链DNA（dsDNA）。双链结构的刚性降低它与nanoCoTPyP之间的吸附力，导致核酸探针离开nanoCoTPyP表面和荧光恢复。由于双量子点可在单一激发波长下产生两个发射峰，因此可以在一次实验中同时检测两个耐药基因。此外，还通过使用三维(3D)和二维(2D)nanoCoTPyP，详细探讨了金属有机框架（MOFs）的几何结构和电荷对传感性能的影响。

图1 耐多药基因同时检测机理图    

02方法

该文对5株耐多药结核菌株、3株利福平耐药菌株、5株异烟肼耐药菌株和7株敏感菌株进行全基因组DNA提取，然后进行PCR扩增。随后，对扩增产物进行热变性产生单链并加入到纳米卟啉和双量子点混合溶液中。最后，在380 nm的激发波长下观测溶液的荧光强度。

03结果

通过表面活性剂辅助方法成功合成了四种不同形貌（纳米簇、纳米球、纳米棒和纳米片）的纳米卟啉。首先对其猝灭性能进行比较，结果发现四种纳米卟啉均为较好的猝灭双荧光探针。其中，纳米球因为其表面具有更多可接近的活性位点和带正电荷等因素，显示出更好的猝灭效率。其次，比较了它们的检测性能，发现纳米簇、纳米球、纳米棒都能较好地同时检测目标DNA，而由于核酸探针重新吸附在纳米片的边缘导致其不能用于检测目标DNA。本方法对两个耐药基因在一定浓度范围内显示出良好的线性关系，检出限分别达到24 pM 和20 pM。并且，本方法能识别单个碱基错配的核酸序列，具有较强的特异性。日内日间实验的相对标准偏差都不超过3.3%，表明本方法具有良好的重复性和精密度。此外，对20个临床分离菌株进行检测，发现本方法能准确识别耐多药菌株、单耐药菌株以及敏感菌株。本方法与金标准测序方法对比，检测结果一致，证明了本方法的实用性和可靠性。

04结论和意义

本研究构建了一种新型的基于纳米卟啉和双量子点的可视化荧光传感方法用于同时检测Mtb耐多药基因。通过20个临床分离菌株验证了本方法的实用性和可靠性。结果表明，本方法具有灵敏度高、省时、成本低等显著优势，为结核耐药性诊断和临床用药指导等方面开辟一条新途径。