科研| Microbiome：肠道代谢物预测艰难梭菌复发

导读  

背景：艰难梭菌感染(CDI)是美国最常见的医院获得性感染，复发率>15%。虽然原发性CDI被广泛认为与肠道微生物群失调有关，但对于促进或减轻复发的因素知之甚少。此外，先前的研究并未表明仅通过16S rRNA扩增子测序测定肠道微生物丰度可以准确预测CDI复发。

结果：我们对53名原发性CDI患者进行了前瞻性纵向研究。粪便样本采集在诊断时开始于CDI抗生素治疗前，并在抗生素治疗后持续8周，每周或每周采集两次。样本分析采用(1)16S rRNA扩增子测序，(2)液相色谱/质谱代谢组学测量1387种注释代谢物，(3)短链脂肪酸分析。扩增子测序数据显示，复发参与者的微生物多样性恢复明显延迟，关键厌氧类群在多个时间点消耗，包括梭菌簇XIVa和IV类群。代谢组学数据也显示复发参与者的恢复延迟，而且映射到表明微生物组或宿主中明显功能异常的通路，如微生物解偶联活性降低、内源性大麻素水平降低和宿主细胞损伤标志物升高。此外，使用预测性统计/机器学习模型，我们证明了代谢组学数据(而不是其他数据源)可以准确预测原发性CDI治疗后1周(AUC 0.77[0.71, 0.86; 95%区间])和2周(AUC 0.77 [0.69, 0.85;95%区间])的未来复发。

结论：我们的CDI复发研究的前瞻性、纵向和多组学性质使我们能够揭示此前未被认识的微生物组动态和预示宿主复发，特别是阐明了未充分研究的肠道代谢组的变化。此外，我们证明了一小组代谢物可以准确预测未来的复发。我们的研究结果对诊断测试和治疗的发展具有重要意义，通过为诊断开发提供候选代谢生物标志物，以及提供对保护或允许复发的复杂微生物和代谢改变的见解，最终可能会缩短CDI复发周期。

论文ID

原名：Gut metabolites predict Clostridioides difficile recurrence

译名：肠道代谢物预测艰难梭菌复发

期刊：Microbiome

IF：14.650

发表时间：2022.6.9

通讯作者：Georg K. Gerber

通讯作者单位：美国哈佛医学院

DOI号：10.1186/s40168-022-01284-1

实验设计

结果

1 测量肠道微生物组成和代谢组的复发性CDI的纵向研究
我们对53名受试者的系列粪便样本进行了多组学分析(图1)，这些受试者参加了布莱根妇女医院(BWH)和两个附属医院的CDI父母前瞻性纵向研究。在父母研究中，在诊断时(如果有的话)、抗生素治疗后1周、每周或半周收集粪便样本，最长持续8周。多组学研究的参与者是根据第1周粪便样本的可用性从父母研究中选择的，非复发者与复发者的期望比例约为2:1，以充分支持预测分析，同时最大化研究资源，以及非复发者与复发者之间的年龄和性别匹配。这产生了一个由34名非复发参与者和19名复发参与者组成的多组学研究队列。表1提供了该队列的人口统计学和临床数据。附加文件1中提供了参与者的合并症。唯一发现与CDI复发显著相关的人口统计学或临床变量是使用酶联免疫分析(EIA)检测vs. PCR初步诊断CDI(p=0.046)。这一发现与父母研究的分析一致，可能是由于较高的假阳性率或用PCR测试检测到不含毒素的艰难梭菌( Clostridioides difficile )菌株。父母研究还发现，与万古霉素相比，甲硝唑治疗初始CDI与复发有关；在我们的多组学研究分析的患者子集中，这种相关性仅具有临界显著性(p=0.12)，可能是因为样本量较小。注意，虽然父母研究发现血小板计数和CDI复发之间存在显著关联，但由于在我们的多组学研究中超过25%的参与者缺少血液研究数据，我们无法对参与者子集分析该变量。

图1 艰难梭状芽孢杆菌感染(CDI)前瞻性研究，测定肠道微生物和代谢物以开发复发预测因子。53名首次CDI的参与者在初始CDI抗生素治疗后进行了长达8周的随访。在CDI抗生素治疗前、治疗后1周、然后每周一次或每周两次收集粪便样本，直到复发或研究期结束。采用16S rRNA基因扩增子测序分析粪便样本中的微生物组成。采用液相色谱/质谱(LC/MS)非靶向代谢组学和靶向短链脂肪酸分析法测定粪便样本中的代谢物。
表1 参与者人口统计和临床数据

对二 元变量进行Fisher精确检验，对分类变量进行卡方检验，对连续变量进行Wilcoxon秩和检验。 PCR，聚合酶链反应，GDH，谷氨酸脱氢酶，PPI，质子泵抑制剂。 表2提供了分析的粪便样本的总结。因为所有复发参与者都是在初始治疗后的前3周内复发的，所以我们后续的分析主要集中在第3周之前的数据点上。该时间窗口为统计测试提供了足够数量的重复样本，同时，在未来开发诊断测试的背景下，也为临床可操作决策提供了一个相关的时间周期。采用(1)16S rRNA扩增子测序、(2)液相色谱/质谱(LC/MS)非靶向代谢组学和(3)靶向短链脂肪酸(SCFA)分析对每个样品进行分析。对于扩增子分析，总共产生了了4,605,740条测序reads(平均每个样品~10 K/reads)，随后使用dada2进行生物信息学处理产生了2509个独特的扩增子序列变异(ASVs)。LC/MS非靶向代谢组学平台定量了1387种独特且注释的代谢物。SCFA分析量化了9种代谢物：乙酸盐、丙酸盐、异丁酸盐、丁酸盐、异戊酸盐/2-甲基丁酸盐(无法通过使用的平台区分)、戊酸盐、异己酸盐、己酸盐和庚酸盐。但庚酸盐和己酸盐分别只存在于一个或两个样品中，因此在随后的分析中被去除。
表2 每个时间点分析的样本数量。

注： 5名参与者在第1周复发，因此他们的样本不包括在第1周分析中。
2 复发参与者在CDI抗生素治疗后表现出肠道微生物群多样性和组成恢复较慢 

为了深入了解微生物群落的结构，我们使用α和β多样性度量评估了它们的整体生态多样性。为了更详细地了解微生物群落，我们在扩增子序列变异(ASVs)水平上分析了分类组成。在过滤低丰度/稀有分类群后，我们获得了237个ASVs，将其用于后续的DESeq2倍数变化分析。由于参与者接受了万古霉素或甲硝唑的初始CDI治疗，并且已知这些抗生素对肠道微生物组有不同的影响，我们在DESeq回归模型中纳入术语来解释所使用的抗生素类型，并且只报告在控制抗生素类型时仍然显著的变化。对于生态多样性水平和ASV水平的分析，我们进行了组内分析(即同一组内不同时间点之间ASV多样性或丰度的差异，无论是非复发者还是复发者)和组间分析(非复发者和复发者之间ASV多样性或丰度的差异)。
我们首先调查了组内多样性的变化，比较了复发者或非复发者CDI治疗前与CDI抗生素治疗1周后的多样性。在这些比较中，复发组(p=0.04)和非复发组(p=2×10 -4 )的α多样性均显著降低(图2;  附加文件2)，这与CDI抗生素治疗期间肠道微生物的减少一致。我们使用Bray-Curtis相异度评估了组内β多样性，并发现了相似的模式(图S1)：在复发者(p=5×10 -3 )和非复发者(p=10 -3 )中都观察到了显著变化。接下来，我们评估了第1周到第2周的组内多样性，有趣的是，α和β多样性仅在非复发组内显著恢复(分别为p=3×10 -5 ，和p=10 -3 )(附加文件2)。 在每个时间点比较复发组和非复发组间的α多样性，我们发现在CDI抗生素治疗后第2周的α多样性存在显著差异，非复发组的α多样性更高(p=9×10 -4 )(图2，附加文件2)。我们没有发现组间β多样性的显著差异。综上，这些组内和组间多样性分析表明，复发和非复发受试者均预期抗生素治疗CDI会降低肠道微生物群落生态多样性，但复发受试者表现出微生物多样性恢复延迟。 接下来，我们使用差异丰度分析检测了ASV丰度随时间的组内差异。在非复发患者中，30个ASVs在第1周到第2周之间的丰度有显著差异。在这30个ASVs中，25个ASVs表现出显著增加(附加文件3)。在这些ASVs中，15个属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)，代表该细菌科的显著富集(FDR=0.003，附加文件4)，它们通常是具有特殊生态位的严格厌氧菌，与正常的微生物组功能相关。在复发患者中，13个ASVs在第1周到第2周的丰度存在显著差异，其中8个ASVs表现出显著增加。这组ASVs没有表现出任何特定类群的显著富集，并且与在非复发者中观察到的变化相比，只有一个来自毛螺菌科的ASV(ASV 76)从第1周到第2周表现出显著增加(附加文件3)。
最后，我们评估了ASV组成的组间差异，比较了CDI治疗前、CDI治疗后第1周和第2周的非复发者和复发者之间的差异。该分析显示，非复发者在CDI治疗前有10个ASVs，在CDI治疗后第1周有15个ASVs，在第2周有35个ASVs(图3A;  附加文件3)。第2周ASV丰度增加时，拟杆菌科(FDR=0.03)、瘤胃球菌科(FDR=0.03)和毛螺菌科(FDR=0.03)的分类群显著富集(附加文件4)。这些科中的许多分类群在非复发者中显著增加，这些分类群与正常的微生物组功能相关，包括毛螺菌科中的梭菌簇XIVa类群(ASVs 90、97、99、198、214)，以及瘤胃球菌科中的梭菌簇IV类群(ASVs 59、60、62、66)(附加文件3)。有趣的是， Clostridium scindens (ASV 99)是非复发者梭菌簇XIVa类群中丰度较高的一个类群(在第2周显著，在其他时间点有丰度较高的趋势)，其已被证明可提供宿主对艰难梭菌的抗性。在非复发者中发现的其他一些丰度较高的属先前已在人类研究中证明与预防CDI有关，如拟杆菌属( Bacteroides ，ASVs 26、28、29、32、33、34)和韦荣氏菌属( Veillonella ，ASV 154)。
综上所述，这些类群丰度的组内和组间比较表明，正常微生物组在复发者中的消耗更广泛，甚至在CDI抗生素治疗前也很明显，但随着时间的推移，差异越来越明显，这与复发患者的微生物群恢复较慢相一致。

图2 复发者肠道微生物群的生态多样性恢复明显慢于非复发者。α多样性(Chao指数)是衡量物种丰富度的指标，在复发组和非复发组中，CDI抗生素治疗前至1周后均显著下降。CDI治疗后1~2周，α多样性仅在非复发组内显著恢复。在CDI抗生素治疗后2周，复发组和非复发组之间的α多样性仅存在显著差异，非复发组的α多样性更高。R=复发者，NR=非复发者。

图3 CDI复发和非复发参与者之间的肠道微生物群和代谢物水平存在显著差异。A.对16S rRNA基因扩增子测序数据的单变量分析发现，237个扩增子测序变异中(ASVs)中有51个ASVs在复发者和非复发者之间存在显著差异。B.LC/MS非靶向代谢组学的单变量分析发现，1387种代谢物中有22种在复发者和非复发者之间存在显著差异。显示的代谢物水平是对数转换和标准化的。R=复发者，NR=非复发者。箭头表示统计上显著效应的方向。参与者(列)通过分层聚类在图中进行排序。
3 复发参与者表现出肠道代谢组的改变，表明肠道微生物组功能降低，宿主炎症和免疫调节能力降低
我们首先进行了排序分析，以评估复发者和非复发者之间肠道代谢谱的整体变化和差异(图S2)。与我们对微生物多样性变化的发现相同的是，代谢组学数据(过滤后的760种代谢物)排序分析显示，从CDI治疗前到CDI治疗后第1周(p=10 -3 )以及从CDI治疗后的第1周到第2周(p=10 -3 )，非复发者的代谢组均发生了显著变化，但复发者的代谢组仅从CDI治疗前到CDI治疗后第1周发生了显著变化(p=10 -3 )(附加文件2)。在每个时间点比较复发患者和非复发患者，差异仅在第2周显著(p=0.001)，这概括了我们在微生物组α多样性方面的发现(附加文件2)。综上所述，我们看到了整体肠道代谢组学特征和微生物多样性的平行模式，复发者和非复发者最初表现出相似的肠道代谢组，仅在CDI抗生素治疗后第2周出现显著差异，因为复发组恢复较慢。 为了确定哪些肠道代谢物影响了代谢组恢复或无法恢复的总体模式，我们对代谢组数据(图3B，附加文件3)和靶向SCFA数据(图S3，附加文件3)进行了单变量分析(控制CDI治疗中使用的抗生素，如上所述)，包括跨时间点以及复发者和非复发者之间的单变量分析。
从第1周到第2周的代谢物变化仅在非复发患者中显著，有131种代谢物在一周内发生了显著变化。这些代谢物在次级胆汁酸(FDR=0.06)、初级胆汁酸(FDR=0.06)、羟酰基肉碱(FDR=0.06)、皮质类固醇(FDR=0.07)、食物成分(FDR=0.07)和二糖/寡糖(FDR=0.10)方面的富集程度接近显著水平(附加文件4)。从第1周到第2周(附加文件3)，短链脂肪酸的变化同样仅在非复发患者中显著，其中6种SCFA在第2周显著增加：乙酸盐(FDR=6×10 -5 )、异戊酸酯/2-甲基丁酸(FDR=4×10 -4 )、丁酸盐(FDR=10 -3 )、戊酸盐(FDR=0.03)、异丁酸(FDR=0.03)。比较复发者和非复发者的肠道代谢物水平，研究中显示出越来越大的差异。在预处理时，未发现复发者和非复发者之间的代谢物有显著差异。然而，在CDI治疗后第1周，发现香草扁桃酸(FDR=0.05)在复发患者中显著升高。
在第2周，21种代谢物的丰度在复发者和非复发者之间存在显著差异(附加文件3)，其中18种代谢物在复发患者中含量较高。随着时间的推移，复发者和非复发者肠道代谢组之间的差异越来越大，这一模式与微生物组组成的模式相似，表明复发者的肠道代谢组恢复较慢。 观察到的代谢物的特定变化或差异通常可以分为三类，表明(1)宿主炎症或肠道损伤，(2)缺乏微生物解偶联活性，(3)宿主免疫和炎症能力的改变。香草扁桃酸(VMA)是儿茶酚胺代谢的最终产物，此前有报道称其是炎症的生物标志物，在CDI治疗后1周复发者中较高。在CDI治疗后第2周，细胞死亡的生物标志物在复发者中显著升高。在第2周，区分复发者和非复发者的全部代谢物中含有大量鞘磷脂(FDR = 7×10 -4 ，附件4)，包括lignoceroyl鞘磷脂d18:1/24:0，鞘磷脂d18:2/24:1、d18:1/24:2、鞘磷脂d18:1/20:0、d16:1/22:0和behenoyl鞘磷脂d18:1/22:0。除了鞘磷脂外，磷脂棕榈酰-2-硬脂酰-GPC 16:0/18:0在复发者中也显著增高。鞘磷脂和磷脂代谢物升高以前与活动性肠上皮损伤有关，例如在CDI小鼠模型和CDI或IBD人类模型中。 在第2周，复发者代谢组中也存在肠道微生物功能受损的证据。葡萄糖醛酸苷和硫酸盐结合物在复发者中显著增高，包括5种类固醇结合物(孕二醇-3-葡萄糖苷、雌酮-3-硫酸酯、11β-hydroxyetiocholanolone glucuronide、etiocholanolone glucuronide和四氢皮质酮葡萄糖醛酸)和另外4种葡萄糖醛酸化化合物(胡椒碱代谢物C17H21NO3的3种葡萄糖醛酸和水杨酸葡萄糖醛酸)。肠道微生物对于解偶联作用至关重要；因此，复发者中结合代谢物水平升高可能表明这种正常微生物组功能的恢复明显迟缓。微生物组对于转化胆汁酸也很关键。
事实上，两种胆汁酸，牛磺胆酸(FDR=0.006)(一种初级胆汁酸)和牛磺鹅去氧胆酸-3-硫酸盐(FDR=0.03)(一种初级胆汁酸结合物)在复发者中显著升高，这再次表明微生物组功能恢复延迟。有趣的是，牛磺胆酸和其他胆酸衍生物已被证明可促进体内艰难梭菌的萌发，尽管它们在体外发病机制中的作用尚不清楚。胆红素代谢是肠道菌群的另一个主要功能。胆红素代谢的最终产物D-尿胆素在复发者中明显降低，这也表明微生物组功能缺乏恢复[FDR=0.01]。较高水平的SCFA表明肠道微生物群代谢活跃。与上述讨论的其他代谢物的肠道微生物失调情况一致，乙酸盐(FDR=0.07)和异戊酸/2-甲基丁酸盐(FDR=0.07)的水平在复发者中较低，具有临界显著性。 在第2周，参与宿主免疫或炎症调节的代谢物水平，主要是共轭抗炎化合物和内源性大麻素，在复发者和非复发者之间也存在显著差异。在非复发者中观察到的结合皮质类固醇水平较低不仅表明微生物去结合活性更强，也可能表明宿主抗炎活性增强：非结合皮质类固醇(如四氢皮质酮)是关键的抗炎化合物，非结合性类固醇也被证明是肠道炎症的重要调节剂。
其他发现在复发者中明显更高的共轭化合物，特别是胡椒碱葡萄糖醛酸、水杨酸葡萄糖醛酸和芹菜素硫酸酯，也显示出具有抗炎作用的非共轭形式。在复发患者中，内源性大麻素behenoyl ethanolamide  (FDR=5×10 -4 )和lignoceroyl ethanolamide  (FDR=0.04)的水平显著降低。内源性大麻素已被证明可以通过调节免疫系统和肠道运动来维持肠道稳态；此外，内源性大麻素在 Akkermansia muciniphila 存在的情况下增加，我们发现该类群在第2周的非复发者中明显更多(ASV 9，FDR=2×10 -19 )。综上所述，这些结果表明复发者调节炎症的能力降低。
4 使用代谢组学数据实现复发预测模型的最高准确性
为了估计我们的数据在多大程度上可以预测患者的CDI复发，我们建立了有监督的机器学习/统计模型，并使用交叉验证对其进行了评估。这种方法与前几节中介绍的单变量统计检验在两个方面有根本区别：(1)单变量方法一次评估一个变量，因此无法发现组合效应(例如，如果多种代谢物升高，风险会增加)，(2)统计检验方法无法提供预测准确性的估计，也不能提供模型对未知数据的性能。这两种能力对于开发临床有用的诊断是必要的，这是该领域的一个重要目标。对于预测任务，我们评估了三种标准方法：lasso-logistic回归(LR)、随机森林(RF)和lasso-Cox回归(CR)。前两种方法预测二元结果(复发或不复发)，而CR预测复发时间。我们根据这些方法使用交叉验证方法预测结果的能力对其进行了评估(在数据子集上训练模型并在保留数据上进行预测)。对于预测二元结果的两种方法，我们使用接受者操作曲线下面积(AUC)得分作为评估指标，对于CR，我们使用一致性指数(CI)。
本研究使用以下信息对参与者CDI治疗前、第1周和第2周的样本进行LR、RF和CR：(1)先前研究中发现的与复发相关的临床变量(年龄、既往PPI使用、治疗方案和诊断方法)，(2)来自16S rRNA扩增子测序的ASV，(3) LC/MS非靶向代谢组学，(4)SCFAs，以及(5)所有数据源(1-4)合并。总体而言，我们发现第1周和第2周的LC/MS代谢组数据具有最高的预测准确度(图4附加文件5)。对于预测复发/不复发，在第1周，代谢组数据上的LR达到最高的AUC(0.77;[0.71, 0.86] 95%区间)，而在第2周，代谢组数据上的RF达到最高的AUC (0.77;[0.69, 0.85] 95%区间)。其他数据源或时间点的AUC得分均未超过0.7，这通常被认为是一个可接受的临床试验的阈值(0.8到0.9被认为是优秀的)。使用所有可用数据源组合预测复发的模型与仅使用代谢组学数据的模型获得了基本相同的AUC(图4)；此外，这些模型只始终选择代谢物作为预测所需的显著特征(附加文件6)。使用CR预测生存时间遵循类似的趋势，因为所有达到CIs>0.7的模型仅选择代谢物进行预测。CDI治疗前ASV和SCFAs的AUC中位数均接近0.7(ASV使用LR的AUC中位数为0.68，SCFA使用RF的AUC中位数为0.68)。然而，这些AUC的95%交叉验证区间很大，其较低范围延伸到接近0.5的值(随机)。
因此，这些预测变量缺乏稳健性或普遍性。在我们的研究中，缺乏准确的治疗前预测因子可能受到样本量的限制，因为与第1周和第2周(分别为N=48和N=40)相比，CDI治疗前可用的样本较少(N=26)。 为了确定哪些代谢物在中位AUC>0.7的模型中具有预测性，我们评估了交叉验证的优势比和基尼特征重要性度量。
在第1周，LR、RF和CR均选择N-氨基甲酰天冬氨酸和香草扁桃酸作为最高预测因子，两者在较高水平时都有利于复发(图5)。值得注意的是，在单变量分析中还发现这些代谢物在第1周的复发者中显著增加。在第2周，RF确定了lignoceroyl sphingomyelin是一个重要特征；单因素分析也发现，这种代谢物在复发者中明显更丰富。RF还确定了在单变量分析中发现的具有临界显著性的特征，包括鞘磷脂、初级胆汁酸和一种磷酸化脂质(图5)。预测模型还确定了单变量分析中未检测到的特征：在第1周LR模型中，4-羟基马尿酸盐和胆红素被确定为在较高水平时可预测复发。4-羟基马尿酸盐是水果和其他植物性食品中多酚的微生物降解产物。胆红素是宿主血红素分解代谢的产物，并被肠道微生物群进一步还原为尿胆素/尿胆原，因此其在复发者肠道代谢组中的较高水平与低于标准的微生物组功能相一致。由于所采用的预测方法做出了不同的基本假设(例如，逻辑回归是广义线性模型，而随机森林是非线性模型)，因此由多个模型选择的代谢物更有可能是稳健的。因此，通过多种方法确定的一组预测性代谢物(图5)可作为未来试验的有力候选者，以在更大的独立队列中验证用于复发预测的生物标志物。

图4 利用代谢组学数据使CDI复发预测建模达到了最高的准确性。采用留一交叉验证法评估预测模型的性能(CDI治疗前N=26，第1周N=48，第2周N=40)。模型输入的数据源为(1)以往研究中与复发相关的临床变量(年龄、既往PPI使用情况、抗生素治疗方案和使用的CDI诊断测试)，(2)非靶向肠道代谢组学，(3)肠道微生物组扩增子测序变异(ASVs)，(4)肠道短链脂肪酸(SCFAs)，(5)数据源1-4合并。使用曲线下面积(AUC)指标评估预测二元标签(复发/不复发)的lasso和随机森林的逻辑回归性能。用一致性指数(CI)评估预测生存时间的Cox回归。达到中值≥0.70 AUC或CI得分(足够性能)的模型用红色虚线矩形表示。发现具有≥0.70 AUC或CI的所有数据模型仅选择代谢组学特征。

图5 多种预测方法揭示了复发前宿主或微生物相关过程的代谢改变。37种代谢物在至少一种区分CDI复发与非复发状态的分析方法中具有重要意义。这些代谢物分为三类，反映宿主或微生物群活动的改变。深橙色或绿色表示显著性(单变量分析中FDR<0.05)。浅橙色或绿色表示临界显著性(单变量分析中FDR<0.05)。

讨论

据我们所知，我们的研究是利用微生物组测序和非靶向代谢组学分析对CDI复发进行的最大的前瞻性研究。虽然之前的研究已经调查了微生物组与CDI之间的某些方面的关系，但我们的研究设计和分析方法使我们能够进一步探索。本研究的纵向性质使我们能够调查微生物组恢复率与复发之间的关系。由于横断面研究设计或缺乏系统的纵向抽样，过去关于CDI复发的研究无法观察到抗生素治疗后不久复发者和非复发者之间微生物多样性的显著差异。Seekatz等人的研究虽然是纵向的，但并没有对所有参与者在同一时间点进行采样；因此，尽管他们注意到复发者微生物群落的α多样性趋于低于非复发者，但他们无法评估各组在特定时间窗口内α多样性的动态变化。此外，我们研究的前瞻性使我们能够建立CDI复发的预测模型，这是采用横断面设计所不可能实现的。
此外，通过收集广泛的肠道代谢组数据，我们能够确定这些数据比微生物组成数据更准确地预测CDI复发。微生物测序数据的预测能力有限可能是由于以下几个因素，包括缺乏关于宿主过程状态的数据、检测重要低丰度生物的灵敏度较差，以及无法从肠道中执行类似功能的不同细菌物种中找到共同信号。然而，专门为结合微生物组成和代谢组数据而定制的预测计算模型也有可能产生额外的信息并提高预测准确性。 我们的研究结果对设计复发性CDI的诊断测试和治疗干预具有重要意义。在CDI诊断时，我们没有发现复发者和非复发者之间的明显差异。相反，我们发现复发者从生态失调中恢复的速度明显较慢，在CDI抗生素治疗2周后，恢复不完全仍然很明显。
此外，我们发现，在CDI抗生素治疗后1周，与宿主炎症相关的特定代谢物生物标志物水平的增加准确地预测了未来的复发。综上，这些发现表明，在CDI治疗后的1-2周内针对特定代谢物的诊断测试可能是最准确的和临床有用的。此外，通过确定一小组能够准确预测复发的代谢物，我们为开发基于有限生物标志物的可行临床测试奠定了基础，该测试可以通过靶向LC/MS或临床实验室已有的其他平台进行经济高效的测量。 我们的研究还揭示了肠道代谢组的复杂和动态差异，无论是在时间上还是在复发者与非复发者之间，这可能为预防或治疗复发性CDI提供了新的途径。例如，我们发现在症状出现之前，复发者的鞘磷脂、鞘脂和磷脂水平升高。在晚期急性CDI小鼠、IBD儿童和CDI+IBD儿童的肠道中都发现了这些脂质，这些脂质可能是肠道炎症的早期生物标志物，因为艰难梭菌开始发挥致病作用，但尚未引起明显腹泻。有趣的是，这些脂质最近被证明是由常见肠道细菌合成的，并影响血管内皮功能和炎症反应。因此，在复发者中观察到的这些代谢物的增加可能至少部分反映了微生物组的代谢活动，这可能通过调节宿主炎症和免疫过程来加剧CDI的发展。复发者中内源性大麻素的减少同样可能涉及宿主和微生物组之间的相互作用，因为最近的证据表明，肠道微生物调节内源性大麻素以控制宿主的能量代谢和肠道功能。
虽然我们的研究设计和分析方法产生了对复发性CDI更好的诊断和更有效的治疗有意义的结果，但我们的研究确实存在一些局限性，这为进一步研究提供了机会。本研究主要在一家医院进行，大多数参与者在研究开始时是住院患者。这些因素可能部分解释了为什么我们的父母研究的复发率为29%，高于其他一些研究报告的复发率，如Guh等人报告的复发率为15%。然而，其他研究报告了与我们的研究更高或相似的比例。例如，Seekatz等人报告了他们队列中93名参与者的34%的复发率，Khanna等人报告在他们的88名参与者队列中有28.5%的复发率。不同研究中CDI复发率差异的原因可能是多方面的，包括参与者人口统计和合并症的差异。导致CDI复发率不同的另一个因素可能是时空趋势，可能涉及机构和周围社区内高致病性艰难梭菌菌株的循环。我们的研究进行了大约三年，时间相对较短，并且没有评估艰难梭菌的遗传学。 另一个需要考虑的因素是，在我们的研究中，参与者接受万古霉素或甲硝唑进行初始CDI治疗。在我们的队列中，大约42%的复发患者接受了甲硝唑治疗，而非复发患者接受甲硝唑治疗的比例为21%。
虽然这一差异在我们的队列中没有统计学意义，但在较大的父母队列中，这表明这种效应也存在于我们较小的队列中，但由于样本量有限，未能达到统计学显著性水平。事实上，甲硝唑曾被认为是CDI复发的风险因素，因此更新的美国传染病学会临床指南取消了甲硝唑作为CDI一线治疗药物的推荐。此外，万古霉素和甲硝唑具有完全不同的作用机制，已知对微生物组有不同的影响。当我们在统计模型中控制用于治疗初始CDI的抗生素类型时，我们仍然发现许多细菌类群和代谢物与复发/非复发状态显著相关。此外，我们发现肠道代谢物(而不是用于初始CDI治疗的抗生素类型)在统计和机器学习模型中可以显著预测未来CDI的复发，这些模型获得了交叉验证的性能。这些研究结果表明，复发者和非复发者之间的微生物群存在显著差异，而这些差异并不仅仅是由最初用于CDI治疗的抗生素的差异驱动的。但抗生素、肠道环境和CDI复发之间的高阶混杂仍然是一个明显的可能性，进一步的研究对于阐明这些影响很重要。
因此，评估接受万古霉素统一治疗的更大、更多样化队列的后续多机构研究，以及整合艰难梭菌基因组分析数据，对于推广我们的研究结果非常重要。另一个我们的研究设计无法解决的有趣问题是，代谢物生物标志物是否反映了允许CDI的肠道病理，而不是CDI在症状出现之前造成的早期损伤。最后，CDI预测因子(如本研究发现的代谢物生物标志物)的真正临床价值需要在其用于告知早期干预显著降低复发率的效用的背景下进行评估。 

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