研究 | Nature：人类微生物组编码抗糖尿病药物阿卡波糖的耐药性

编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

人类微生物组编码了大量的生化酶和途径，其中大部分仍未得到表征。在本研究中，我们使用基于宏基因组学的搜索策略，发现人类肠道和口腔微生物组的细菌成员编码酶，这些酶选择性地磷酸化临床使用的抗糖尿病药物阿卡波糖，导致其失活。阿卡波糖是人类和细菌α-葡萄糖苷酶的抑制剂，可限制目标生物体代谢复杂碳水化合物的能力。使用生化分析、X射线晶体学和宏基因组分析，我们表明微生物组衍生的阿卡波糖激酶对阿卡波糖具有特异性，为其保护生物体提供对抗阿卡波糖活性的保护优势，并且广泛存在于西方和非西方人群的微生物组中。这些结果提供了一个微生物群对非抗生素药物普遍耐药的例子，并表明阿卡波糖耐药性已在人类微生物群中传播，并作为对抗密切相关分子的潜在内源性生产者的防御策略。 

论文ID

原名：The human microbiome encodes resistance to the antidiabetic drug acarbose

译名：人类微生物组编码抗糖尿病药物阿卡波糖的耐药性

期刊：Nature

IF：49.962

发表时间：2021.11

通讯作者：Mohamed S. Donia

通讯作者单位：美国普林斯顿大学

DOI号：10.1038/s41586-021-04091-0

实验设计

结果

1 人类微生物群对阿卡波糖的灭活作用 阿卡波糖是从土壤细菌放线菌SE50/110中发现并在工业上生产的。在生物合成基因簇（BGC）内编码一种用于阿卡波糖（acb）生产的自我抗性机制；一种特定的激酶AcbK在O6A羟基处磷酸化阿卡波糖，使其失去活性（图1a）。从概念上讲，任何编码相同功能的细菌都会对阿卡波糖产生类似的抗性。因此，我们使用两种方法在人类微生物组中计算搜索编码AcbK同源物的基因：

（1）在NCBI和人类微生物组项目（HMP-1-1）组装的宏基因组支架上对细菌分离物的基因组进行BLAST搜索；

（2）使用MetaBGC对来自五个不同队列（HMP，包括HMP-1-1和HMP-1-2，MetaHIT，Chinese和Fijicomp）的3212个人类微生物组样本的未装配宏基因组测序数据进行搜索。综合起来，我们的搜索确定了82个基因（其中70个全长），被指定为微生物组编码的碳水化合物激酶（mck1–mck82）（方法，补充表1和2以及扩展数据图1）。 接下来，我们测试了计算确定的Mcks是否确实可以磷酸化和灭活阿卡波糖。我们构建了70个全长Mcks的系统发育树，其中包括来自土壤细菌的三种已知磷酸化阿卡波糖的蛋白质（AcbK、GacK和ScatK），以及充分表征的来自大肠杆菌的ATP依赖性6-磷酸果糖激酶（PfkB )。系统发育树显示了一个包含21个Mcks的大型进化枝，它们与三个阳性对照（AcbK 进化枝）聚集在一起（图1b和扩展数据图2）。我们合成了9个mck基因的密码子优化DNA序列（8个来自AcbK分支的不同亚类，1个来自外部分支），以及阳性对照AcbK，用于在大肠杆菌中表达重组蛋白。在成功表达和纯化后，我们将得到的蛋白质与ATP和阿卡波糖一起孵育，并使用高效液相色谱与质谱联用 (HPLC-MS) 定量阿卡波糖和磷酸化阿卡波糖的反应后水平（扩展数据图3和补充图1）。

我们计算了9种蛋白质中每一种观察到的反应速率（kobs），并将它们归一化为AcbK的kobs（我们计算为0.034 s-1；补充表3）。来自AcbK进化枝的8种测试蛋白质的kobs比AcbK慢17倍到快2倍（图1c）。只有来自AcbK进化枝之外的Mck23的kobs比AcbK的kobs慢300倍以上。因此，我们指定了来自AcbK进化枝微生物组衍生的阿卡波糖激酶 (Maks) 的所有8种测试蛋白质，还指定了来自该进化枝推定的Maks(pMaks)的未经测试的蛋白质（图1b）。接下来，使用MetaBGC（方法），我们检测了来自所有主要身体部位（肠道、口腔、皮肤和阴道）和五个国家（美国、中国、丹麦、西班牙和斐济）的3212份样本中mak和pmak基因的表达。值得注意的是，13个mak和pmak基因在口腔样本中最为普遍（249/264，占HMP参与者的94%，144/243，占斐济参与者的59%，在其口腔样本中编码至少一个mak或pmak基因），尤其是在龈上菌斑样本中（229/230，占HMP参与者的99%）。

个体口腔mak和pmak基因的流行率差异很大（口腔样本中HMP参与者的8%至81%），其中mak1分布最广（213/264，81%的HMP参与者）且最丰富（图1d、扩展数据图4和补充表2）。从分离的基因组中发现的口腔mak和pmak基因由放线菌门（如放线菌）、厚壁菌门（如Solobacterium moorei）和梭杆菌门（如Leptotrichia trevisanii）中的多种细菌编码，根据宏基因组数据确定的mak和pmak基因预计来自相同的3个门（图1b和补充表1）。 虽然在肠道微生物组中偶尔可以检测到几种口服mak和pmak基因，但只有一种基因——mak16，由肠道血厚壁菌编码，仅在肠道中发现（25/301，占HMP参与者的8%；7/194，占中国人的4%；21/193，占Fijicomp的11%；34/318，占MetaHit的11%）。最后，我们分析了几个公开的转录组数据集，并检测到至少两个不同个体的口腔微生物组样本中12个mak和pmak基因与粪便微生物组样本中一个基因（mak16）匹配的转录组读数（方法和补充表2）。综上所述，这些结果表明阿卡波糖失活酶的同系物广泛存在于不同人群的口腔和肠道微生物群中。  图1. 从人类微生物组中发现Maks的宏基因组学。a，阿卡波糖BGC（acb）（顶部）。底部，AcbK磷酸化阿卡波糖以产生阿卡波糖-O6A-磷酸盐。b，本研究中发现的AcbK同源物的最大似然系统发育树，使用MEGA7构建（参考文献42），在分支点显示的1000个重复中，引导值>50%。该树包括先前表征的阿卡波糖激酶（红色）、来自大肠杆菌的PfkB、经实验验证的Mck具有（绿色、Maks）或缺乏（蓝色）阿卡波糖-O6A-激酶活性，以及未经实验测试的（黑色），以及未经实验测试的（黑色）。PMAK表示AcbK分支中假定的MAK。起源细菌的门用阴影框表示。星号表示该门是由于宏基因组起源而被预测的。完整的树如扩展数据图2所示。c，每个实验表征的Mck/Mak相对于AcbK的速率，如b中所示。单个重复的值（n = 2或n = 3） 显示为小圆圈。原始数据见补充表3。扩展数据图3和5中显示了代表性的HPLC–MS和HPLC高分辨率（HR）–MS/MS数据。d，热图显示了五个分析队列中mak和pmak基因的选定子集的丰度，这是由MetaBGC计算的（未显示无映射读取的样本）（顶部）。使用UPGMA（具有算术平均值的未加权配对组方法）在R. Bottom的pheatmap中进行分层聚类，在HMP队列中两个身体部位的同一组mak和pmak基因的患病率（阳性个体的百分比）。所有队列中所有mck基因的患病率和丰度如扩展数据图2和补充表2所示。

   2 Mak1和AcbK的相似酶动力学

我们进一步表征了最丰富和分布最广的Mak，Mak1。首先，我们测试了Mak1对阿卡波糖的磷酸化是否会导致其失活，正如AcbK报道的那样。我们使用比色法测定了AcbK或Mak1产生的阿卡波糖及其磷酸化形式对人唾液淀粉酶和猪胰腺淀粉酶的抑制活性（扩展数据图5）。虽然阿卡波糖在浓度为10 μM时能完全抑制这两种酶，在相同浓度下（图2a、b和补充表4），两种磷酸化形式（由AcbK或Mak1产生）均未观察到抑制作用。这些结果证实了Maks对阿卡波糖的磷酸化导致其失活。其次，我们测试了阿卡波糖是否是Mak1的首选底物；已知碳水化合物激酶磷酸化结构相似的底物。我们将Mak1和AcbK与8种不同的碳水化合物和氨基糖苷一起孵育，并计算它们与每种底物的观察反应速率。Mak1和AcbK均表现出对阿卡波糖的强烈偏好，而对相关化合物几乎没有磷酸化作用（扩展数据图6）。 最后，我们还测试了Mak1磷酸化阿卡波糖的酶动力学是否与AcbK的酶动力学相似。我们确定阿卡波糖的表观米氏常数（Km）对于Mak1为 424 μM，对于AcbK为428 μM（图2c和补充表3），表明阿卡波糖作为底物也有类似的偏好。值得注意的是，Mak1的kcat（多重转化催化速率常数）为16.4 s−1，而 AcbK 为 8.2s-1，表明在类似的实验室条件下，Mak1磷酸化阿卡波糖的速度比AcbK快。在不同的底物浓度（图2c和扩展数据图6）和温度（扩展数据图6和补充表3）下，一致观察到这种差异。此外，在固定的ATP和阿卡波糖浓度下，酶浓度增加100倍会导致AcbK的kobs线性增加100倍，而Mak1的kobs非线性增加约1000倍。因此，Mak1是一种协同酶（Hill系数） = 1.71 ± 0.06），而AcbK不是（Hill = 1.13 ± 0.02）（扩展数据图6和补充表3）。这些结果表明，Mak1和AcbK在底物选择性、催化活性和Km方面非常相似，但在kcat和协同性方面略有不同。   图2. Mak1和AcbK以相似的酶动力学磷酸化和灭活阿卡波糖。 a，b：猪胰腺淀粉酶（a）和人唾液淀粉酶（b）的比色淀粉酶活性测定。405处吸光度的增加 nm（y轴，每30分钟测量一次 s） 表明寡糖底物模拟物（亚乙基) -pNP-G7) 和显色染料 (p-硝基苯酚) 作为淀粉酶活性的直接寡核苷酸的释放。尽管任一淀粉酶与10 μM阿卡波糖完全消除其活性，与Mak1或AcbK产生的相同浓度的阿卡波糖-O6A-磷酸（Acb-O6A-P）孵育不再具有抑制作用。a和b中绘制的数据来自单个实验。补充表4给出了本实验和第二次重复实验的原始数据，显示了相同的结果。c.AcbK（灰色）和Mak1（蓝色）的Michaelis–Menten饱和曲线。Km和kcat值以各自的颜色表示，两种酶的单独kobs测量重复在图上显示。S0为初始底物浓度，E0为酶浓度。原始数据见补充表3。  

  3 AcbK和Mak1的结构分析 为

了了解这两种激酶是如何识别和磷酸化阿卡波糖的，我们通过X射线晶体学以2.4 Å的分辨率测定了与阿卡波糖和非水解ATP类似物腺苷酸亚氨基二磷酸（AMP-PNP）结合的AcbK的晶体结构和分辨率为3.1 Å的等效Mak1络合物 Å（补充表5）。Mak1和AcbK结构相似（均方根偏差 = 1.12 Å代表272个Cα原子），具有42%的序列同一性，与大肠杆菌核糖激酶PfkB（蛋白质数据库（PDB）：1RKD）具有相同的整体折叠。这种核糖激酶的单体由两个结构域组成：一个核心α/β结构域和一个朝向N-末端的较小的五链β-折叠（图3a）。AcbK和Mak1通过五链β-片的二聚作用在晶体中形成同型二聚体，形成“β-扣环”，其包含Mak1中的残基13-41和93-113，以及AcbK中的残基14-42和94-115（图3b和扩展数据图7）。β-环扣内多肽链之间的相互作用广泛，高达1298个 Å2的表面积，形成一个小的疏水核。β-环扣内的每个β-片包含来自二聚体中两个单体的β-链，尤其是一个单体的β3与另一个单体的β8（图3b和扩展数据图7）。β-卡环还形成阿卡波糖结合位点的一面，来自一个单体的β3与同型二聚体中另一个单体的活性位点的边缘接触，形成阿卡波糖结合位点上盖子的一部分（图3b和扩展数据图7）。相反，由AMP-PNP占据的ATP结合位点完全包含在每个单体中。 阿卡波糖底物在β-环和α/β结构域之间形成的核糖激酶折叠裂缝内以延伸构象结合。每个阿卡波糖分子可埋藏多达501Å2的一个单体表面积和94 Å2在每个二聚体中的另一个单体上。阿卡波糖的阿卡维菌素部分（A和B环；图1a）不同于相关低聚糖，并在阿卡波糖和激酶之间产生最广泛的相互作用。A环上的每个羟基与AcbK:Ser109上的残基形成氢键，与阿卡波糖O2A形成氢键；含O3A的Asn99；Asp16与O4A；以及带有O6A的Asp248（扩展数据图7）；Mak1中分别有Ser108、Asn98、Asp15和Asp247（图3c）。这些氢键残基在所有测试和确认的MAK中都是保守的，可能对稳定阿卡波糖A环很重要（图3d和扩展数据图7）。阿卡波糖B环和激酶之间的相互作用涉及两个氢键：阿卡波糖O2B与AcbK中的Asn165和Ser31（Mak1中的Asn163和Ser30），并由二聚体中的两个单体贡献，环夹在芳香侧链的表面之间：AcbK中的Trp111和His164，或Mak1中的Tyr110和His162。与环A和环B相反，环A和环B牢牢地固定在活性位点裂口的最深部分，环C和环D位于裂口的较浅区域，与蛋白质缺乏氢键（图3c和扩展数据图7）；因此，阿卡波糖激酶的底物特异性主要来源于与独特的阿卡维辛部分的相互作用。 

在PfkB中，核糖磷酸化的拟议机制是通过核糖的O5′羟基脱质子，引发它对ATP33的γ-磷酸的亲核攻击。在Mak1和AcbK活性位点中观察到的构象与这一机制一致：阿卡波糖的O6A羟基处于理想位置，可以作为亲核试剂并攻击AMP-PNP的γ-磷酸。与典型核糖激酶一样，AcbK中Asp248的羧酸侧链（Mak1中的Asp247）将从O6A羟基中提取质子，Mn+2金属离子与AMP-PNP的β-和γ-磷酸盐配位，将它们对齐以进行攻击（图3和扩展数据图7）。在AcbK和Mak1晶体结构中，不可水解的ATP类似物AMP-PNP阻止阿卡波糖的磷酸化，并在磷酸转移前立即以构象稳定底物结合激酶。在AcbK中，O6A-Pγ距离为3.50 Å和阿卡波糖O6A亲核试剂与AMP-PNP的Pγ和N3β原子呈共线，以便将磷酸基团转移到阿卡波糖（扩展数据图7）。对于AcbK，His164（Mak1中的His162）与Mn+2离子配位，而Asp162（Mak1中的Asp160）与三个金属结合水分子中的两个形成氢键（图3e和扩展数据图7）。 与此机制一致，AcbK中的Asp248、Asp162和His164以及Mak1等同物在所有测试的MAK中绝对保守（扩展数据图7）。

我们为这三个残基构建了突变体，并在Mak1的D247A、D160A突变体和D160A/H162A双突变体中观察到阿卡波糖磷酸化活性分别降低713倍、7倍和300倍（扩展数据图6和补充表3）。最后，添加金属螯合剂EDTA完全消除了反应，证实了酶的金属依赖性活性（扩展数据图6）。这些结果表明，这两种酶采用相同的阿卡波糖磷酸化机制，这类似于先前表征的核糖激酶。   图3. Mak1和AcbK的晶体结构显示了它们的结构相似性和特定的阿卡波糖相互作用残基。 a，并列比较Mak1和AcbK与阿卡波糖底物和AMP-PNP结合以及配位金属（Mn+2，紫色球体）极为相似的结构。这两种蛋白质形成典型的核糖激酶折叠，其中底物结合在两个主要结构域之间的一个小裂缝中：核心α/β结构域和形成二聚体界面的较小的β-扣合结构域。b，左图中，Mak1在两个单体之间形成具有广泛相互作用的均二聚体，最显著的是一个单体的β3和另一个单体的β8（黄色突出显示框；为了清晰起见，每个单体的β-链用不同的阴影表示）。所示为分子表面视图（右侧），其中一个Mak1单体颜色为红色，另一个颜色为紫色，突出显示了广泛的表面积（1298 Å2）通过β-环结构域参与形成二聚体。c，Mak1底物结合袋的放大图，其中广泛的氢键网络与阿卡波糖A环中的所有羟基形成，并将其固定到位。显示了每个氢键的距离。d，Mak1活性位点的放大图，其中显示了重要的残基（Asp160、His162和Asp247），这些残基都参与引发阿卡波糖的O6A羟基进行亲核攻击，并促进磷酸盐从ATP（显示的AMP-PNP）转移到阿卡波糖的O6A羟基。所示的距离是从O6A羟基到γ-磷酸盐的距离。扩展数据图7中提供了用于AcbK的对应的一组图。

  4 Mak1提供阿卡波糖抗性

我们设计了一株口腔粘滞放线菌菌株来表达mak1，并将其在阿卡波糖存在下的复杂碳水化合物依赖性生长与含有空载体对照的等基因菌株进行了比较（方法）。我们选择口腔粘滞放线菌有两个原因：mak1由相关的口腔放线菌属天然携带（补充表1），并且该菌株的遗传操作已经成功。在24 h和48 h的生长后，mak1的表达导致了几种阿卡波糖浓度的显著生长恢复（图4a，扩展数据图8和补充表6）。这些结果表明，Mak1能够保护表达它的细菌免受阿卡波糖的碳水化合物依赖性生长抑制作用的影响，这让人想起通过失活产生的耐药性，尽管是对非抗生素药物的耐药性。   图4. Maks的生物学相关性和Mak1在人类口腔微生物组中的潜在来源。a.24 h正常化细菌生长，测量为600 nm时的光密度，以未处理对照的百分比表示。条形图表示对每种受试菌株使用不同阿卡波糖浓度的处理：表达mak1（蓝色）的粘菌和含有空载体对照（灰色）的粘菌。mak1的表达导致阿卡波糖的碳水化合物依赖性生长抑制活性在统计学上显著恢复。误差条表示s.e.m.n = 4。采用假设不相等方差的两样本t检验进行统计分析* P  < 0.01:P = 1.02 × 10−5 (0.5 μM），P = 2.48 × 10−6 (1 μM），P = 1.07 × 10−9 (5 μM），P = 1.45 × 10−4 (10 μM），P = 7.07 × 10−8 (50 µM）和P = 1.26 × 10−3 (100 µM）。原始实验数据见补充表6和48 h后测得的类似数据图见扩展数据图8。b、c.接受阿卡波糖治疗的mak 阳性（n = 8，红色）和 mak 阴性（n = 8，蓝色）的2型糖尿病患者的 HbA1c (b) 和空腹血糖 (c) 水平的百分比变化。在阿卡波糖治疗开始后第28、56和84天，采用双侧Student t检验比较mak阳性和mak阴性患者；*P < 0.05，**P < 0.01：HbA1c，P = 0.031（第28天），P = 0.046（第56天）和P = 0.003（第84天）；空腹血糖，P = 0.026（第84天）。数据是平均值 ± s.d。d.比较了从Streptomyces glaucescens合成阿卡波糖的gac BGC和从人类口腔微生物组的宏基因组测序数据中发现的末端BGC。绿色阴影条连接两个BGC中的同源基因，根据指示的成对蛋白质序列识别色码。

   5 mak载体与治疗反应 

为了测试Maks对阿卡波糖的灭活是否会影响其治疗效果，我们分析了最近使用阿卡波糖进行的人体临床试验的数据。虽然本研究最初旨在评估膳食纤维对肠道微生物组和抗糖尿病治疗的影响，但本试验的对照组（U组，16名患者）包括仅使用阿卡波糖治疗84天而未进行饮食干预的2型糖尿病患者；在第0、28、56和84天收集粪便宏基因组测序数据和疾病相关生物标记物。我们将16名患者的粪便宏基因组测序读数映射到上述发现的21个mak和pmak基因序列上，以确定患者是mak阳性（在其微生物组中编码任何mak或pmak）还是mak阴性（在任何患者样本中均未检测到mak或pmak基因）。使用该标准，一半患者被认为是mak阳性，而另一半被认为是mak阴性，两组患者之间没有性别或年龄差异（方法和补充表7）。接下来，我们检查了mak阳性和mak阴性患者对阿卡波糖治疗的反应是否不同。有趣的是，我们观察到两个患者组在血红蛋白A1c（HbA1c）水平的百分比变化（治疗后所有三个时间点）和空腹血糖水平（第84天；图4b，c）方面存在统计学显著差异。当比较绝对值而不是百分比变化时，也观察到类似的结果（扩展数据图8）。

值得注意的是，这些差异遵循的模式与肠Maks—mak阳性患者中潜在的阿卡波糖失活一致，而这个模式与mak阴性患者相比，治疗反应减弱。尽管这些结果很有希望，但考虑到试验中的样本量小以及许多其他患者内在因素可能在抗糖尿病治疗反应中起作用，应谨慎解释这些结果。

  6 内源性阿卡波糖样分子 

人类口腔微生物组中编码阿卡波糖抗性的基因（99%的HMP参与者的龈上菌斑样本）几乎无所不在，这使得我们假设该部位是阿卡波糖或阿卡波糖样分子的内源性天然来源。为了验证这一假设，我们从几个相应的亚基因组或分离基因组（方法）中组装并注释了包含mak基因的基因组位点，然后在相同的遗传邻域中搜索类似已知阿卡波糖生物合成酶的编码蛋白质：3个已知的阿卡波糖 BGC（acb、gac 和scat) 编码同一簇内的阿卡波糖激酶。值得注意的是，我们发现一个微生物组编码的BGC与gac非常相似，并编码核心阿卡波糖生物合成酶的同系物（图4d、扩展数据图8和补充表8和9）。

我们称这种BGC末端为内源性产生的阿卡波糖样分子或内碳糖。 end是在口腔微生物组的宏基因组支架中发现的，包括mak1（在end中编码时称为endM）。根据其侧翼基因预测end存在于口腔放线菌属中（图4d、扩展数据图8和补充表1）。通过将3212份样本的宏基因组读数映射到末端，我们发现它只存在于口腔微生物组（HMP和Fijicomp中），并且与mak1类似，它在龈上菌斑样本中最为普遍。有趣的是，对单个末端基因的分析表明，它们可以存在于龈上菌斑样本中的五种不同遗传背景（遗传变异）中：作为完整的14基因BGC（69/230，30%的HMP参与者），作为截断的8基因、4基因或2基因簇（均包括mak1（endM）；分别在12%、7%和19%的HMP参与者中），或作为独立的mak1基因（在39/230中，17%的HMP参与者中）。我们的分析还揭示了几个跨末端基因覆盖率不同的宏基因组样本，这与同一样本中至少两种基因变体的共存一致（方法、扩展数据图9和补充表10）。end的发现、其与gac的惊人相似性，以及end和mak1在龈上菌斑样本中令人惊讶的遗传背景表明，抗性基因从本地内卡波糖的原始生产者传播到同一生态位的非生产者。  

讨论

我们的发现有两个主要意义：首先，阿卡波糖样分子的潜在内源性产生，以及微生物组的某些成员通过磷酸化失活对这些分子的影响的抵抗揭示了微生物竞争复合碳水化合物的潜在机制。这让人想起阿卡波糖在土壤环境中作为条件抑菌剂的假定生态作用，并为人类微生物组成员之间碳水化合物介导的相互作用的复杂网络增加了一个新的层面。其次，Maks的发现代表了一个偶然但特殊的微生物组对非抗生素、人类靶向药物产生耐药性的例子，并揭示了微生物组-阿卡波糖相互作用的临床重要机制。我们的人类临床试验数据表明，肠道微生物群中的mak携带可能影响抗糖尿病反应；尤其是肠道特异性mak（mak16，由T. sanguinis编码）和偶尔在肠道中检测到的口腔mak基因（如口腔放线菌属的mak1和mak5）通常由存在于小肠的细菌编码，阿卡波糖的大部分治疗作用发生在小肠。后期需要对肠道和口腔微生物组进行纵向宏基因组分析，并对大量长期服用阿卡波糖的患者进行详细的临床反应评估，以明确评估携带mak基因是否能预测微生物组的变化和/或治疗效果。 

原文链接 ： https://www.nature.com/articles/s41586-021-04091-0