利用蛋白微阵列技术筛选结核结核分枝杆菌潜伏感染的新型血清标记物

2022
06/10

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中国防痨杂志期刊社
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在验证阶段进一步使用ELISA方法对300多份血清样品生物标志物面板进行验证,最终结果表明芯片检测结果与ELISA检测结果基本一致。

Novel serological biomarker panel using protein microarray can distinguish active TB from latent TB infection

Li J, Wang Y, Yan L, Zhang C, He Y, Zou J, Zhou Y, Zhong C, Zhang X.

Microbes Infect, 2022 May 19: 105002.

doi: 10.1016/j.micinf.2022.105002.

PMID: 35598729.

近日,《微生物和感染》(Microbes Infect)杂志发表了江西省感染性疾病临床医学研究中心(江西省胸科医院)和中科院生物物理研究所合作的利用蛋白质微阵列技术探寻结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)的新型血清学生物标志物的研究(Novel serological biomarker panel using protein microarray can distinguish active TB from latent TB infection.Microbes Infect, 2022 May 19: 105002. doi: 10.1016/j.micinf.2022.105002.)。该研究构建了含64种结核分枝杆菌(MTB)相关抗原的结核蛋白芯片(其中43种来自DosR家族,21种来自文献报道的蛋白),筛选出4种蛋白(Rv1860、RV3881c、Rv2031c和Rv3803c)的最佳标记组合,并计算出含有这4种蛋白的生物标志物对区分活动性结核病(ATB)和LTBI的敏感度为93.3%、特异度为97.7%,对区分ATB和健康对照组(HC)的敏感度为86%、特异度为97.6%。江西省胸科医院结核科的李杰为文章的第一作者,张学钰为论文的通信作者。

研究背景

在鉴别LTBI和ATB方面由于缺乏有效的诊断方法,阻碍了结核病的预防和控制。目前,结核病的实验室诊断仍依赖于传统的方法,包括抗酸染色(AFS)、核酸扩增(NAA,如GeneXpert MTB/RIF)、痰液及其他呼吸道标本的MTB培养,但这些方法均有一定的局限性,如痰分枝杆菌培养需要2~8周才能获得培养结果,而且阳性率较低,不能满足临床要求;痰涂片法虽然周期较短,但特异性较差;尽管GeneXpert MTB/RIF的检测速度快、敏感度高,但不能解决阴性MTB的检测问题。γ-干扰素释放试验也是辅助结核病诊断的一种方法,但仍不能区分ATB和LTBI。因此,临床诊断迫切需要更准确、更易于操作的结核病诊断工具。

预防LTBI发展为ATB是结核病防治的重要策略之一。LTBI人群的筛选和鉴定需要新型生物标志物和技术。由休眠生存调节因子(DosR)编码的MTB抗原由于在MTB休眠状态期间上调而被认为是潜伏感染研究的良好候选抗原。本研究中,我们选择了21个文献报道的MTB蛋白和43个DosR家族的蛋白作为候选抗原。选择酿酒酵母表达系统重组表达64个MTB候选蛋白。在表达和纯化所有候选蛋白后,我们构建了MTB蛋白芯片用于样品筛选。在生物标志物开发的探索阶段,共收集了180份血清样本,包括60份ATB患者样本、60份LTBI者样本和60份HC者样本,从中筛选出5种蛋白,然后使用logistic回归分析建立模型,得到含有5种抗原的生物标志物组合,可有效区分ATB患者和LTBI人群。在验证阶段进一步使用ELISA方法对300多份血清样品生物标志物面板进行验证,最终结果表明芯片检测结果与ELISA检测结果基本一致。

标记物的筛选·

1.抗原的纯化与鉴定:在本研究中,MTB抗原在酿酒酵母中表达。每个抗原的N-末端都用谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标记,以利于抗原的纯化和鉴定。候选蛋白经GST亲和层析纯化和抗GST抗体鉴定。

2.蛋白质微阵列分析试验的可靠性:我们在玻片上发现纯化的重组蛋白和对照(洗脱缓冲液、GST、BSA和组蛋白)一式两份,并通过抗GST抗体探测评估微阵列的质量(图1A)。由64个MTB H37Rv蛋白组成的微阵列,包括43个DosR蛋白(图1A)和21个文献报道的MTB蛋白。对荧光信号的前景强度(F)和背景强度(B)的分析表明,蛋白质微阵列具有较低的背景信号(平均信号强度值为100),而前景荧光信号强度较高(平均信号强度值为13 796)。前景强度曲线(图1B)和背景强度曲线几乎完全分离,表明微阵列上的蛋白质可用于随后的血清样本检测。

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图1  MTB相关蛋白芯片A的质量控制

为了评估实验间的稳定性和重复性,在总共7个独立阵列上测定相同的混合血清样品(QC样品)。阵列间的平均相关系数为0.98,每对复制蛋白点的皮尔逊相关系数(R2)均大于0.99(HC:0.99;LTBI:0.99;ATB:1),表明从微阵列获得的结果是稳定和可重复的。

3.MTB蛋白微阵列鉴定出差异抗体:如上所述,在探索阶段我们使用MTB蛋白微阵列来分析相对较少的血清样本(分别来自ATB患者、LTBI者、HC者的各60份样本)。每份血清样本在MTB蛋白微阵列上孵育,微阵列上针对蛋白质的抗体通过开发具有Cy3标记的抗人IgG抗体和Cy5标记的抗人IgM抗体的阵列来鉴定。从微阵列获得的数据首先使用微阵列显著性分析(SAM)算法进行处理。根据微阵列的中值对信号强度进行标准化,并在两组之间进行比较以确定差异抗体,阈值设置为P值<0.05且倍数变化>1.1。使用这些标准,在ATB与HC、ATB与LTBI的比较中分别鉴定了19种和12种差异蛋白(图2A、2B)。维恩图比较分析结果显示,5种蛋白质(Rv1860、Rv2031c、Rv3881c、Rv3803c和Rv0526)在ATB与HC和ATB与LTBI之间均存在显著差异(图2C)。蛋白质微阵列的荧光信号结果表明,这5种蛋白质可以区分ATB组与HC组和LTBI组(图2D)。

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图2  以微阵列为基础选择活动性肺结核患者或结核分枝杆菌潜伏感染患者或健康对照者血清样本中不同水平的抗原

4.ROC分析与推导出ATB诊断组合面板:为了确定诊断ATB的潜在血清生物标志物,我们绘制了这5种蛋白的受试者操作特征(ROC)曲线,并计算了曲线下面积(AUC),而且还使用了箱线图来分析比较这5种抗原组间的差异。结果显示,血清中5种蛋白的抗体在ATB、LTBI和HC组间的差异均有统计学意义(P值均<0.05)(图3A)。分别计算每种蛋白的敏感度和特异度。用ROC曲线下面积评价5种蛋白的诊断价值。5种蛋白质的AUC值在0.599~0.725之间(图3B),敏感度介于19.3%~38.6%之间。虽然在血清中发现了一系列与ATB相关的抗体,但没有任何一种抗体在区分ATB与LTBI和HC个体方面有突出的表现。

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图3  不同组间候选生物标志物抗体检测结果

通过对候选抗原不同组合的分析计算,最终筛选出4种蛋白(rv1860igg、Rv3881c-IgG、Rv2031c-IgG和Rv3803c-IgG)进行模型构建。首先,将数据随机分为两组,一组作为训练集(70%样本),另一组作为测试集(30%样本)。然后利用随机森林建立模型,得到一个具有良好性能的面板,用于区分ATB与LTBI或HC人群。在训练集中,ATB与HC、ATB与LTBI和LTBI与HC的ROC曲线下面积分别达到了0.973、0.981和0.964(图4)。优化后的4种蛋白组合检测对区分ATB与HC的敏感度为86%、特异度为97.6%,对区分ATB与LTBI的敏感度为93.3%、特异度为97.7%。在测试集中,ROC曲线下的面积值相似(>0.9)(图4),表明该面板在区分ATB与LTBI个体和健康个体方面的稳定性。结果表明,4种蛋白(rv1860igg、Rv3881c-IgG、Rv2031c-IgG和Rv3803c-IgG)的组合面板具有良好的诊断性能,可用于诊断ATB和LTBI。

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图4  使用MTB相关蛋白微阵列样本的生物标志物检测各组的ROC曲线

5.采用ELISA法验证ATB生物标志物组合:为了评价所鉴定抗原的应用价值,我们采用ELISA方法对这些生物标志物进行了验证,并添加了300份独立血清进行ELISA实验,纯化了4种候选抗原(Rv1860、Rv3881c、Rv2031c和Rv3803c)并用于ELISA检测。结果与使用蛋白质微阵列发现阶段的结果一致。4种蛋白质在ATB组中显示出明显高于HC组或LTBI组的信号。我们还使用ELISA实验的结果来评估随机森林模型生物标记物面板的性能。ROC曲线下面积分别为:训练集中ATB组与HC组、ATB组与LTBI组、LTBI组与LTBI/HC组的ROC曲线下面积分别为0.976、0.971和0.972;区分ATB与HC的敏感度和特异度分别为91.2%和98.8%,区分ATB与LTBI的敏感度和特异度分别为93.3%和97.7%。

研究意义和展望

血清学生物标志物是一种操作简便、快速、无创的疾病诊断技术,因此,从临床医生的角度出发,筛选新的结核病血清学生物标志物具有重要意义。4种蛋白(Rv1860、Rv2031c、Rv3881c和Rv3803c)检测水平显示,ATB患者血清抗体水平明显高于LTBI组和HC组。本研究的4抗原组合在治疗过程中和治疗后疗效评价过程中的应用和表现值得进一步研究。

注:除非特别声明,本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社观点。

译稿:李    杰

编辑:孟    莉

审校:范永德

发布时间:2022-06-10

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关键词:
蛋白,ATB,LTBI,MTB,微阵列

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