Nature子刊：朱听团队实现镜像核酸的定向进化，并拓展了在疾病诊疗中的应用

构成生命的天然核酸与蛋白质具有手性单一特性：天然核酸均由 D 型核糖组成，天然蛋白质几乎均由 L 型氨基酸组成。朱听课题组致力于从遗传信息中心法则出发，利用化学、生物学等多学科手段构建与天然生物分子手性相反的“镜像生物学系统”。至今，该课题组已初步实现了镜像中心法则中的镜像核酸复制、转录、反转录等过程，突破了 90 kDa 以上大型镜像蛋白质全化学合成和千碱基长度镜像基因合成的技术瓶颈，开发了镜像 PCR 扩增、镜像核酸测序、镜像 DNA 信息存储等技术，目前正在着力构建镜像蛋白质翻译系统以实现完整的镜像中心法则，并尝试进一步拓展镜像生物学系统的实际应用。

核酸适配体（aptamer）是一类能特异性结合靶标分子的单链DNA或RNA分子。传统核酸适配体为天然DNA或RNA，极易被天然核酸酶降解；而镜像核酸适配体为镜像DNA或RNA，无法被天然核酸酶降解，具有优异的生物稳定性。此前，镜像核酸适配体主要通过化学方法合成镜像靶标分子并借助于天然核酸的定向进化间接筛选得到（图1）。但化学合成镜像靶标分子的过程复杂且种类有限，主要局限于小分子或小型多肽、蛋白质，因此该间接筛选方法的实现难度大且缺乏普适性，制约了镜像核酸适配体的筛选与应用。

2022年6月6日，朱听课题组在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Directed evolution and selection of biostable L-DNA aptamers with a mirror-image DNA polymerase 的研究论文。

研究团队经过近六年的研究探索，建立了镜像核酸的定向进化与镜像DNA适配体的直接筛选方法，简称为“镜像筛选（mirror-image selection）”。

研究团队从包含约1014条随机镜像DNA序列的文库中筛选出特异性结合人凝血酶（human thrombin）的镜像DNA适配体，并开发了基于该适配体的凝血酶传感器、蛋白免疫印迹（Western blot）技术及具有抗凝血作用的凝血酶抑制剂，拓展了镜像生物学系统在疾病诊疗领域的应用。

实现镜像筛选的关键步骤之一是镜像 PCR 扩增。研究者使用该课题组之前报道的镜像 DNA 聚合酶 PCR 扩增包含约1014条随机镜像 DNA 序列的文库，并将其与凝血酶结合，经过多轮结合、洗脱与镜像 PCR 扩增，得到了特异性结合凝血酶的镜像 DNA。实现镜像筛选的另一个关键步骤是鉴定镜像 DNA 适配体的序列。研究者利用变性梯度凝胶电泳（DGGE）对筛选出的镜像 DNA 进行分离纯化，并优化了该课题组之前报道的镜像 DNA 测序技术，鉴定出数个对凝血酶具有高亲和力的镜像 DNA 适配体序列。

  图1：“镜像筛选（mirror-image selection）”方法示意图

在此基础上，研究团队将镜像 DNA 适配体设计为传感器用于检测人血清中凝血酶的浓度。得益于镜像 DNA 优异的生物稳定性，镜像 DNA 适配体传感器在人血清中可长时间稳定存在并准确检测人血清中凝血酶的浓度；而在相同条件下，与之对应的天然 DNA 适配体传感器很快就被人血清中的核酸酶降解，无法准确检测人血清中凝血酶的浓度。研究者还用荧光标记的镜像 DNA 适配体替代传统抗体实现了对凝血酶的蛋白免疫印迹检测。

图2：基于镜像DNA适配体的凝血酶传感器及蛋白免疫印迹（Western blot）技术

研究者进一步发现镜像 DNA 适配体可抑制凝血酶活性，并显著延长人血浆的凝固时间，初步展示了镜像 DNA 适配体在抗凝血治疗中的应用前景。

图3：基于镜像DNA适配体的具有抗凝血作用的凝血酶抑制剂

综上，该研究报道了一种镜像核酸的定向进化与镜像DNA适配体的直接筛选方法，为其在疾病诊疗领域的应用提供了新的技术平台。

清华大学生命科学学院博士后、结构生物学高精尖创新中心卓越学者陈季为该论文第一作者，清华-北大生命科学联合中心博士生陈梦茵为第二作者，朱听教授为通讯作者。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-022-01337-8