ADC非临床安全性考量

随着最近多个ADC的批准， ADC正在成为一类极有前途的生物制药抗癌药物。从非临床安全性的角度来看，由于ADC结合物的复杂性，既包括小分子又包括大分子成分，从而对标准的毒理学测试提出了独特的挑战。这就要在进行进行人体试验前需要一种以科学为导向的安全性评估方法来进行非临床安全性评估。本文就ADC的非临床安全性考量做一个简单介绍。

影响ADC安全的独特特性

ADC具有其独特的生化特性，与单个成分相比，其显著改变了ADC的安全性(表1)。ADC的独特特征之一是PK谱；结合显著影响非结合组分的半衰期、清除、消除和生物分布。未结合抗体涉及分解代谢和靶标介导的清除途径，而小分子弹头通常通过肝脏和肾脏途径清除。ADC的清除涉及到大分子和小分子的性质。结合物首先通过分解代谢以产生ADC代谢产物，或者进行去结合以产生裸抗和弹头成分。一旦被分解，抗体就会被降解成氨基酸，供循环使用，而弹头则会经历肾脏和肝脏的清除。这种消除的差异会影响ADC的半衰期。未结合的单抗的半衰期一般为1至3周，而ADC的半衰期一般仅为2至5天。这种对半衰期的影响与ADC的整体稳定性有关。结合物可以将弹头的半衰期从几个小时延长到几天。非结合组分的生物分布也受到结合作用的显著影响。抗体主要局限于血浆空间，扩散到组织中的速度很慢，而小分子弹头的分布体积通常要大得多。而结合后则将弹头限制在血浆和抗体靶向的细胞和组织。

表1. ADC的独特特性

靶上毒性

理想的ADC靶点是在肿瘤细胞上高表达，在正常细胞上低表达或不表达。然而，在现实中，几乎所有的靶蛋白都有一定程度的正常组织表达，这可能是ADC发展的主要障碍。靶上毒性的一个众所周知的例子是bivatuzumab mertansine，一种与DM1结合的抗人CD44v6抗体。IHC显示CD44v6表达于角质形成细胞和角膜及扁桃体上皮细胞。在观察到剂量依赖的皮肤毒性后，bivatuzumab mertansine的Phase 1试验被停止，最终导致一例毒性表皮坏死松解的死亡病例。这种以角质形成细胞凋亡和脱屑为特征的发现被认为与皮肤中CD44v6的表达有关；其他DM1 ADC在临床上没有表现出类似的毒性。然而，仅根据表达模式很难预测On Target的潜在毒性(表2)。对于Kadcyla®(T-DM1)，临床试验中观察到的主要剂量限制毒性是血小板减少和肝酶升高，尽管靶标表达在胃肠道、肺、皮肤和乳房的心肌细胞和上皮细胞。从这个例子中可以清楚地看出，靶标上的毒性不仅仅是由靶标表达驱动的，而其他因素--例如增殖/靶细胞/器官的再生潜力、弹头的机制/效力以及ADC对靶细胞的可及性也可能会发挥作用。

表2. ADC介导的靶上和靶外毒性临床应用实例

靶外毒性

靶外毒性是指在不表达靶点的器官/细胞中发现的副作用。这些毒性一般与弹头的毒性有关 (表3)。靶外毒性是临床开发中ADC剂量限制毒性(DLT)的主要原因。最初，与微管抑制剂结合的大多数ADC的最大耐受量(MTD)在2至5 mg/kg之间，与靶标表达无关。因此，人们迫切希望提高下一代ADC的治疗指数，而这只有通过更好地了解靶外毒性的潜在机制才能实现。靶外毒性的两个主要机制被认为与(1)结合稳定性和(2)对正常细胞的非特异性摄取有关。

表3. ADC的常见剂量限制毒性

关于结合物不稳定性，即将弹头释放到目标细胞外，增加全身暴露而导致靶标外毒性。影响ADC稳定性的两个主要因素是连接物的选择和用于将弹头连接到抗体上的偶联化学方法。

连接器不稳定被认为是第一代ADC失败的主要原因--包括第一个上市的ADC Mylotarg®。理想的连接物应该足够稳定，可以将ADC运送到肿瘤部位，但又足够不稳定，可以在细胞内迅速释放弹头。当代连接子被分类为可切割或不可切割。大多数可切割连接子被设计为在低pH环境中被酶选择性切割，例如溶酶体。这一方法已得到Adcetris®的临床验证，它使用一种可切割的二肽连接物，在溶酶体内经历组织蛋白酶B的切割。不可切割的连接子必须在细胞内经历分解代谢才能释放弹头。虽然与可切割连接子相比，这些连接子一般表现出更好的安全性，但对治疗指数的影响是不同的，因为在需要旁观者效应的异质性靶表达的肿瘤类型中，不切割ADC的活性通常较低。目前，接头选择/肿瘤类型/疗效/安全性之间的关系尚不清楚，最佳接头-弹头组合必须针对每个ADC进行测试。

影响稳定性的另一个因素是用于将弹头连接到抗体上的结合化学类型。最常见的偶联方法是将药物通过马来酰亚胺基团结合到抗体半胱氨酸或赖氨酸残基上。这个过程也被称为随机结合，产生药物抗体比率(DAR)从0到8的不同种类的ADC混合物。研究发现，在相同的抗体剂量下，较高的DAR ADC比较低的DAR ADC毒性更大。这种影响被认为与更快地清除有关。结合化学的最新进展导致了具有均匀载药量和改善稳定性的ADC的生产。这些技术使用非天然氨基酸、工程半胱氨酸或转谷氨酰胺酶将弹头连接到抗体上的特定位置。研究表明，与随机结合的DAR4 ADC相比，使用位点特定结合产生均一的DAR2 ADC的治疗指数有显著的改善。这些位点特异性的ADC对大鼠和猴子的毒性较低，同时在肿瘤异种移植模型中保持了同等的活性。

虽然ADC对正常细胞的靶非依赖性摄取被认为是靶外毒性的主要组成部分，但关于这方面的毒性机制依然不是十分清晰。抗体被正常细胞以不依赖于抗原的方式摄取的机制有很多，包括Fc受体介导的摄取(如甘露糖受体、FcRn和FcγR受体)、非特异性内吞作用和摄取ADC分解代谢产物等。理论上，非特异性摄取可以导致ADC通过内体或溶酶体途径在细胞内转运，随后在正常细胞内释放细胞毒弹头。然而，目前很少有数据来评估抗原非依赖性摄取对ADC整体非靶点毒性的影响。支持这一假设的最广泛的数据来自一项研究，该研究旨在调查T-DM1介导的血小板减少的机制。这项研究是在观察到尽管缺乏对血小板或血小板前体的靶向表达的情况下，T-DM1患者中剂量限制性血小板减少症的高发生率之后开始进行的。用富含血小板的血浆进行的初步体外研究表明，T-DM1对血小板没有直接影响。然而，巨噬细胞培养的后续研究表明，Alexa488结合的T-DM1在血小板前体中的表面结合和内化。FcRγIIb似乎在非特异性摄取中发挥作用，因为与抗CD32抗体预先孵育使Alexa488结合的T-DM1的内化减少了近两倍。然而，Fcγ受体阻断实验并没有完全阻止巨噬细胞摄取，这表明还有其他非Fc受体机制参与其中。

当前监管机构对ADC的预期

目前还没有专门针对ADC的非临床安全性测试的监管指南。目前的指导仅限于ICHS6(R1)和S9中的小部分。这些文件中涉及的主要原则是物种选择、稳定性(体外和体内)，以及测试结合和非结合物的重要性（表4）。

关于ADC安全评估的监管指南

物种选择

ICHS6(R1)概述了物种选择的原则。一般来说，结合抗体的物种选择应使用与非结合抗体相同的方法--即毒性研究应仅在具有抗体交叉反应的相关物种中进行。在啮齿动物不是相关物种的情况下，安全评估可以限制在是非人类灵长类动物。如果ADC确实结合了啮齿动物和非啮齿动物的靶标，则必须对两个物种同时进行毒理学研究。对于未结合的单抗，在不相关的物种中进行的研究--即没有靶标交叉反应--被认为具有误导性，不被鼓励。这是因为与治疗性单抗相关的大多数毒性与主要药理靶点的过度调节有关。然而，对于ADC来说，这一论点并不成立。高威力的细胞毒性弹头的存在产生了与靶标结合无关的显著毒性。因此，在非交叉反应物种中进行的毒理学可以提供非靶标毒性的相关信息，并有可能被用于指导临床试验设计和开始剂量。

稳定性

如前所述，连接器稳定性是影响ADC安全性的最重要因素之一。这反映在ICHS6(R1)和S9指南中，它们规定ADCs的稳定性和代谢稳定性应该在人类和受试物种血浆中研究。虽然评估ADC稳定性的科学最佳实践尚未建立，但在体外稳定性评估中，通常通过确定37℃持续3至7天的人体和受试物种血浆中DAR的损失来评估。除了体外实验法外，还必须通过测量受试物种中ADC及其未结合组分的血浆水平来进一步评估ADC的稳定性。虽然ICHS9明确指出，ADC的毒代动力学评价应同时评估结合化合物和非结合化合物，但它没有具体说明必须测量哪些单独成分。从资源的角度来看，在非临床开发的早期开发和验证多种生物分析是非常具有挑战性的。最好的评估方法是至少测量总ADC、总单抗(结合和非结合的)和弹头(可切割的ADC)±接头(不可切割的ADC)。这使得能够通过比较血浆中总mAb和ADC的浓度来计算去结合率。

测试结合物与非结合物的重要性

在目前的指南中，与ADC非临床安全性评估相关的另一个具体原则是检测结合蛋白的相对重要性。GLP毒理学研究中的非结合成分。ICHS6(R1)和ICHS9都清楚地表明，ADC应该是非临床安全性评价的主要焦点。此外，两项准则都表示，如果细胞毒剂以前已经过测试，并且有足够的科学资料可用，则可可以不单独评估非结合弹头。对新型细胞毒性弹头的非临床安全性评估ICHS6(R1)建议应遵循用于新型分子实体(NME)的方法，在大鼠中评估弹头的抗原非依赖性毒性。

用于ADC的IND申请所需的非临床安全性研究在表5中概述,不在一一详述。

支持ADC的IND和BLA申请所需的临床安全性研究

小编小结

ADC是由细胞毒性小分子通过稳定的、可切割或不可切割的连接子与抗体共价连接而成的生物制药分子。结合的过程产生了一个高度复杂的分子，其生化性质与非结合组分的生化性质不同。ADC的混合性质突出了安全评估需要一种以科学为基础的方法。监管指南规定，应对该ADC进行全面的非临床安全性评估，以支持使用ADC进行的首例人类临床试验。关键的GLP毒理学研究应在相关物种中进行，以评估潜在的靶标上和靶标外的安全风险。该研究应包括结合组分和非结合组分的毒代动力学分析，以评估稳定性对安全性的影响。还应该了解靶基因的表达，这可以从GLP TCR研究或现有的IHC数据中得出。所有的这些数据应该足以设定临床起始剂量，并为临床监测计划提供信息。这些努力将使得行业和患者受益，增加下一代ADC临床成功的机会。

参考文献

1.Antibody Drug Conjugates: Nonclinical Safety Considerations.

2.A Brief Introduction to Antibody–Drug Conjugates for Toxicologic Pathologists.

3.Risk Minimization of Antibody–Drug Conjugates in Oncology: A Review.

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