建议的关键浓度判定环丝氨酸对结核分枝杆菌的最低抑菌浓度

Minimum inhibitory concentration of cycloserine against Mycobacterium tuberculosis using the MGIT 960 system and a proposed critical concentration.

Wu X, Shang Y, Ren W, Wang W, Wang Y, Xue Z, Li S, Pang Y.

Int J Infect Dis, 2022, 121:148-151.

doi: 10.1016/j.ijid.2022.05.030. 

PMID: 35577251.

近日，《国际感染疾病期刊》（International Journal of Infectious Diseases）杂志发表了首都医科大学附属北京胸科医院细菌免疫室的科研成果，即基于MGIT 960系统和建议的关键浓度来判定环丝氨酸（CS）对结核分枝杆菌的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration of cycloserine against Mycobacterium tuberculosis using the MGIT 960 system and a proposed critical concentration. Int J Infect Dis, 2022, 121:148-151. doi:10.1016/j.ijid.2022.05.030）。作者提出了基于MGIT 960的临界浓度来正确诊断对CS耐药的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB），并证明了alr和ald基因突变是临床分离株对CS耐药的主要机制。首都医科大学附属北京胸科医院细菌免疫室的吴潇和尚媛媛为第一作者，逄宇教授和李姗姗为论文的通信作者。

背景

耐药结核病特别是耐多药结核病（MDR-TB）的出现影响了全球结核病控制工作，占新发患者数的3.3%和既往治疗患者数的18.0%。治疗MDR-TB需要使用更昂贵和抗结核毒副作用更强的抗结核药物，而且这些药物的给药时间也更长。因此，在这些因素的协同作用下，MDR-TB患者的依从性较差，治疗失败率更高。使得药物敏感性试验（简称“药敏试验”）成为成功控制和指导MDR-TB患者治疗的主要依靠，这对获取准确可靠的药敏试验结果提出了重大挑战。

CS是D-丙氨酸的类似物，也是一种有效的抗结核药物，通过竞争性抑制丙氨酸消旋酶（alr）和D-丙氨酸连接酶（ddl）来干扰细胞壁生物合成。目前已经鉴定出参与MTB对CS耐药性的基因是由alr、ddl、丙氨酸脱氢酶（ald）或渗透酶（cycA）基因组成。世界卫生组织（WHO）曾在2018年建议将CS作为MDR-TB的核心二线B组治疗药物的一部分。尽管具有显著的临床意义，但很少预先形成CS的常规表型药敏试验结果，并且由于缺乏可用于药敏试验判读的界断点而未得到WHO的认可。迄今为止，仅有测试MTB分离株的95%MIC的微稀释肉汤方法确立了CS的暂定界断点。为了解决这一问题，研究纳入了有和没有突变的MTB分离株，由全基因组测序（WGS）确定这些菌株对CS耐药性突变。研究的主要目标是确定在MGIT药敏试验体系中MTB对CS的暂定流行病学临界值（TECOFF），并对携带CS抗性的MTB分离株的分子特性进行描述。

方法

1. 细菌菌株和DNA提取：通过简单的随机抽样方法，从2014—2020年在北京胸科医院就诊的肺结核患者中随机选择1组MDR-TB（定义为在体外对异烟肼和利福平都具有耐药性）患者临床分离株，并采用传统比例法和微稀释肉汤法来确定MTB分离株的药敏性。将广泛耐药结核病（XDR-TB）定义为MDR-TB且对氟喹诺酮类药物和至少一种另外A组药物耐药。同时，随机纳入1组从未接触过CS治疗的结核病患者的MTB分离株以确定野生型MIC分布。使用鲸蜡基三甲基溴化铵（CTAB）方法从新鲜细菌中提取MTB的基因组DNA，对所有合格的DNA样品均使用Illumina HiSeq 2000进行WGS分析，通过与参考基因组H37Rv（NC000962.3）的比较，获得靶基因组的一系列单核苷酸多态性（SNP）和插入缺失（InDel），并在研究中仔细检查alr、ddl、ald和cycA基因中可能造成MTB耐药性的突变。

2. 最低抑制浓度：实验通过使用MGIT 960系统确定MIC值。MGIT 960系统对MIC的定义为在无药物对照管的生长单位值>400时保持生长<100生长单位MTB的最低药物浓度。根据欧洲抗菌素敏感性测试委员会（EUCAST）的指南，将TECOFF定义为一种药剂浓度，它可以区分有和没有表型可检测的获得性耐药机制（非野生型）的微生物。此外，在罗氏培养基上将每种分离株的新鲜菌落制备成细菌悬浮液，并调至相当于0.5 McFarland（MCF）标准的浊度。随后，通过将2 ml的0.5 MCF悬浮液稀释在8 ml的无菌盐水中来制备1﹕5稀释液，再将该1﹕5悬浮液制备成1﹕100的稀释液，并从中取0.5 ml加至生长对照管中；同时将0.5 ml的1﹕5悬浮液添加至含有每种药物的测试管中。所使用的最终测试浓度均为从256 mg/L到1 mg/L连续2倍稀释中产生。

3. 统计学处理：将敏感度定义为具有耐药结果的非野生型分离株在所有非野生型菌株中的比例；将特异度定义为具有敏感结果的野生型分离株在所有野生型分离株中的比例。MDR-MTB和XDR-MTB中对CS耐药的菌株比例的比较采用卡方检验。

结果

共计纳入124株MTB分离株用于分析。敏感型分离株中，非耐多药结核病、MDR-TB和XDR-TB的MTB菌株分别为44株（35.5%）、65株（52.4%）和15株（12.1%）。在CS倍比浓度梯度下（0.5～128 mg/L）的体外分离株药敏试验结果显示，MGIT 960系统检测的MIC值为4 mg/L，占所检测分离株的35.5%（44/124）（图1）。

参考H37Rv菌株的MIC为4 mg / L，这与已发表研究中发现的MIC相当。7株分离株携带对CS耐药的突变，包括5个alr突变（分别为2个Leu113Arg，以及Ser22Leu、Met343Thr和399insG突变各1个）、2个ald突变；而其他117株分离株在检测的4个基因位点内均未发生突变，且这些分离株均分离自没有CS耐药病史的患者中。具体见表1。

结论

研究首先建立了基于MGIT 960的临界浓度以正确诊断对CS耐药的MTB。Deshpande等在既往的一项研究中指出，CS的TECOFF为64 mg / L，这一结论比研究中的发现要高很多。这可能与MIC的测定值来源于不同的方法有关。此外，既往的研究主要是基于野生型种群MIC的分布来确定TECOFF，而本研究则是通过比较野生型和耐药型分离株的MIC分布来建立该值。

与先前的研究一致，alr突变是导致MTB对CS耐药性的主要机制，其次是ald突变。值得注意的是，alr位点内的突变是沿着基因散布的，迄今为止首次报道了几种携带CS抗性的新型突变。此外，研究还发现了一种在启动子区携带alr突变的XDR-TB分离株，它的MIC为16 mg /L，这导致敏感型和耐药型菌株对CS敏感性的分布重叠。这也强调了在断点附近的MIC具有高度潜在性错误。

研究的另一个显著发现是，XDR-TB中CS耐药性的比例大大高于MDR-TB，它可能在一定程度内反映了XDR-TB患者的不充分及间歇性治疗或者依从性不好，从而导致突变积累、对各种药物产生耐药性等的问题。由于对半数A组药物的内在抗性，XDR-TB的治疗选择有限，额外的CS耐药性将使这些难治性患者的治疗更为复杂，这种困境凸显了对治疗耐药MTB新药的需求。

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