尿石病的代谢评估， 24 小时尿液的酸化根本不需要？

尿石症代谢评估中， 24 小时尿液的酸化过时了？

Acidification of 24-hour urine in urolithiasis risk testing: An obsolete relic?

Author links open overlay panelJanneCadamuroaCosimaDechoaGlynisFransbSimonAueraAlexandervon MeyerdKathrin M.KniewallnerefMartinDrerupgElmarHeinrichgMartin H.KeppelaCorneliaMrazekaThomas K.FelderaHannesOberkofleraElisabethHaschke-BecheraUlrikeKipmanhTomasSalekiPieterVermeershbcOn behalf of the European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (EFLM) Working Group “Preanalytical Phase” (WG-PRE)

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https://doi.org/10.1016/j.cca.2022.05.010Get rights and content

重点：

•在室温下储存长达72小时时，无需特殊保存24小时尿液样本。

•这一发现有助于样本收集，并可能提高患者的依从性和安全性。

•如果需要，只能在收集后和分析之前进行保存。

关于最佳保存24小时尿液以用于尿石症患者代谢检查有很大的争议。如果正在分析两个具有不同储存条件建议的此类测试，则需要多次收集，特别是老年人和非常年轻的患者。因此，我们旨在评估尿液成分在不同储存条件下的稳定性。材料和方法 我们从十名健康志愿者那里收集尿液样本，并准备等分试样，在室温或4°C下储存。一些等分试样在储存前使用盐酸保存，此后，一些使用BD尿液保存管，一些根本没有保存。储存时间为0，24，48或72小时。在所有样品中，测定钙，镁，磷，肌酐，草酸盐，柠檬酸盐和尿酸，并与相应的参考样品进行比较。结果  与相关的参考样品相比，我们找不到任何分析物和分析前处理条件的任何显着偏差。结论 对于长达72小时的样品储存，可能不需要保存24小时尿液以用于结石形成剂中的代谢评估。

人类自古以来就受到肾结石的折磨。它们已经在5000年前的埃及木乃伊中被发现，包括关于疼痛性绞痛的证据和着作以及用于去除结石的治疗干预。目前，尿石症在一生中的某个阶段影响高达12%的世界人群，男性比女性更常见，年龄在20-49岁之间。尿石症与慢性代谢紊乱（如肥胖、糖尿病或高血压）的关联[3]表明代谢失调是导致尿路结石形成的重要因素。因此，建议在去除结石后对所有患者进行随访，包括代谢风险分层。这种检查通常包括通过红外光谱，偏振光显微镜或X射线衍射分析结石成分。根据结果以及患者是否具有低或高尿石症风险，可以进行靶向代谢筛查，以发现可能导致过饱和度和结石形成的关键因素（代谢和感染）。

结石形成者的代谢评估通常包括家族史、医学史和饮食史、常规血清化学检查、尿液分析和甲状旁腺激素 （PTH） 状态。尿液成分的代谢评估在24小时（24小时尿液）收集的尿液中进行。为了减少细菌污染或化学分解的影响，避免成分沉淀，建议在尿液收集前后添加化学防腐剂。然而，目前的建议是异质的，有时甚至是矛盾的（见表1）。除了处理酸溶液时潜在的患者安全风险外，严格遵守这些建议还需要两次或更多次单独的24小时尿液收集，以防对感兴趣的参数要求不同的化学保存，如CLSI关于尿液分析和收集，运输和保存尿液样本的指南所建议[9].这给患者带来了不便，并可能导致依从性降低，特别是在老年人和年轻患者中。

表 1. 24小时尿液样本收集建议。

1 = CLSI 指南 GP16-A2 [9]。

2 = 尿石症的EAU指南。2022年[8]。

3 =教科书：通过实验室方法进行临床诊断和管理。[40].

4 = 教科书：临床化学和分子诊断的Tietz教科书[41]。

5 = 教科书：临床实验室诊断 2020 [38]。

6 =欧洲尿液分析指南 - 表XXI [36]。

7 = 制造商信息（请参阅材料和方法部分）。

8 = Guder， W. et al.诊断样本的质量 [42]。

9 = Das Laborbuch， [43].

因此，由于支持这些添加剂的必要性的证据稀缺且部分矛盾，我们旨在对基本尿液分析物的稳定性进行广泛的评估，这些分析物包含在不同条件下的尿路结石形成的代谢评估中，用于储存时间，储存温度和添加剂。此外，我们的目标是研究样品储存在4°C或室温下长达72小时的临床影响。

2. 材料和方法

2.1. 研究人群

该研究是在萨尔茨堡大学医院的检验医学系进行的。招募了10名中位年龄为36（21-60）岁的女性志愿者。在过去48小时内没有摄入补充或过量的营养维生素C，也没有肾脏先决条件，如慢性肾脏疾病或尿石症史。

2.2.样品采集 从所有志愿者那里收集了大约 200 毫升点尿样到一个带有螺旋盖且没有任何添加剂的尿液烧杯中（Greiner BioOne，Kremsmünster，Austria）。我们避免收集 24 小时尿液样本，以便能够获得时间点零样本来比较存储的样本。取而代之的是，我们在收集并适当混合后直接制备样品到 21 个不含防腐剂的一次性管（Sarstedt AG & Co. KG，Nümbrecht，德国）和 7 个 BD 防腐管（BD Vacutainer® UA 防腐管；Becton Dickinson GmbH，海德堡，德国） ) 来模拟不同条件下 24 h 储尿的效果。BD管的成分包括：94%丙酸钠（340 mol/管）、5.6%对羟基苯甲酸乙酯、0.4%对羟基苯甲酸乙酯（8.11 mol/管）和氯己定二乙酸酯（0.22 mol/管）。不含防腐剂的试管中均装有 5.5 毫升的尿样。BD 防腐管中充满了 7 毫升尿液，因为这是必需的最小体积。2.3.样品制备和测量 每个志愿者样本的等分试样在分析前条件下进行了不同的处理。一组样品未酸化（非），而另外两组样品分别在收集前（前）和收集后（后）酸化。在这些组中，等分试样在室温（18 至 25°C）或 4°C 下储存 24 小时、48 小时或 72 小时。图 1 概述了这些分析前条件。对于每个酸化组，分析零时间点的参考样品。我们总共模拟了 24 种不同的分析前处理条件。

图 1. 不同储存条件下 24 h 尿样模拟的样品制备。

用盐酸（HCl，每升12摩尔（37%））酸化“前”和“后”样品，以达到2或更低的pH值，这是使用Hydrion Brilliant pH浸渍棒验证的（Micro Essential Laboratory，布鲁克林，纽约，美国）。根据每个样品的初始pH值，使用30至40μlHCl进行酸化。预酸化样品在样品收集和等分试后立即酸化。后酸化样品在储存24，48和72小时后酸化，然后测量。将样品在3000g下离心7分钟，上清液用于Cobas 8000仪器（瑞士罗氏诊断公司，瑞士Rotkreuz）的重复分析，均来自罗氏诊断公司：钙（uCa） - CA2; 镁（uMg） - MG2; 磷（uP） - PHOS2;肌酐（uCrea） - CREJ2。草酸盐（uOx），柠檬酸盐（uCit）和尿酸（uUA）由比利时UZ Leuven大学医院的实验室进行分析。用于这些测量的等分试样在-70°C下深度冷冻，然后装运到干冰上。uua是在Cobas 8000仪器上测量的，uOx使用Trinity Biotech（爱尔兰布雷）的试剂盒，uCit使用R-Biopharm（德国达姆施塔特）的试剂盒。更昂贵的uOx和uCit分析主要在参考样品和相应的72小时存储样品中进行。在与参考样品发生显着偏差时，将测量储存24和48小时的样品。uUA分析仅在非酸化样品中进行，因为推荐的保存将是碱化（表1）。为了避免分析前的错误，应用了PREDICT清单中的建议[10]。对于报告，我们遵守了CRESS报告稳定性研究的清单[11]。

2.4. 统计分析

我们将两种温度条件（室温与4°C）与所有可能的储存持续时间（24小时，48小时，72小时）相结合，并在无酸化设置，预酸化设置，后酸化样品（所有2个×3个组合与参考样品）和BD参考集进行比较，使用多变量方差分析（2×3个MANOVA）和Games Howell事后检查24的显著性使用 IBM SPSS 统计软件 v27（IBM，Armonk，纽约，美国）进行单一比较。

当地伦理委员会批准了这项研究（EK Nr：1080/2021）。所有与会者均给予书面知情同意。

3. 结果

与相关参考样品相比，在任何等分试样中测量的分析物均未显示任何分析前处理条件的显着偏差。所有测量的等分试样的单个结果如图2 A-G所示。所有测量结果均高于相应测定的定量下限。

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图 2.每个健康的志愿者都被描绘成单独的一行。预 - 储存前酸化;后 – 储存后酸化，分析前;BD管储存在Becton Dickinson的保存桶中;RT – 室温。

一个人在非酸化和后酸化以及BD等分试样中储存72小时后显示出草酸盐值的增加。

4. 讨论

在这项研究中，我们没有发现在有或没有防腐剂的样品中测量的测试尿石症风险分层参数的任何显着差异，在分析前在4°C或室温下储存长达72小时。尿石症是一种非常常见的疾病，在其一生中的某个阶段影响世界人口的1.8%至12%，具体取决于国家和性别。根据肾结石（ROKS）列线图的复发率，复发率高达60%，具体取决于年龄，性别，家族史和其他变量[14]。据估计，2000 年美国医疗保健系统的经济负担为 21 亿美元，到 2030 年估计每年将增加 12.4 亿美元 。结石形成者的正确随访，包括尿液代谢筛查，对于决定治疗和二级预防方案非常重要。然而，Song等人回顾性地评估了美国退伍军人系统中的130，489名结石患者，发现只有少数患者（13%）接受了24小时的尿液检查。此外，与那些没有通过24小时尿液检测随访的患者相比，这组患者接受适当药物治疗的可能性显着更高。Harmouch等人报告的数字较高（530例患者中为41%），但仍然太低。这些研究表明，大多数结石患者可能没有得到充分的治疗。收集保存的24小时尿液样本的费力和复杂的过程可能导致这些低数字。

为了检索高质量的样品进行分析，需要确认预分析条件。第一个定义这种分析前影响因素的人是13世纪的拜占庭医生约翰内斯·撒迦利亚·精算师（Johannes Zacharias Actuarius，1275-1328）。他建议使用干净，透明，非常大的膀胱形瓶子收集24小时尿液，防止热，冷和阳光。然而，直到今天，关于如何正确储存24小时尿液的建议差异很大（表1）。一些来源建议酸化尿液以测量某些分析物，一些在储存之前和一些之后，另一些来源建议将尿液储存在4°C，另一些来源再次指出不需要保存。此外，在分析之前允许的存储持续时间因建议而异。只有一些参数，如钾，钠，氯化物或尿素被广泛接受为稳定而不保存。因此，目前的建议可能迫使患者收集两个或两个以上的24小时。

尿液样本，以覆盖结石筛中所有必需的分析物。相应的CLSI指南指出：“当需要多个测试时，样本要求可能会发生冲突。一种方法是收集多个24小时标本。另一种方法是将收集的每个尿液样本混合，将每个尿液样本细分为相等的体积，然后将每个细分倒入适当的大尿液容器中[9].考虑到关于24小时尿液收集的数量仍然存在一些争议 - 大多数作者建议获得两个收集以优化诊断率[4] - 需要四个收集来测量所有诊断成分。对于患者来说，这种尿液收集非常具有挑战性并且容易出错，特别是在儿童和老年人中。对于这些患者，第一天早上尿液样本可能是另一种选择。还应该承认，随着指令的复杂性增加，患者的依从性将降低。由于上述CLSI指南还规定“为了患者和医护人员的安全，目标应该是尽可能避免使用防腐剂”，我们的目标是研究结石形成剂的代谢筛查是否需要防腐剂。24小时尿液收集和样品处理的更实用和更浓缩的过程也可以使快递员和实验室工作人员受益，最终简化某些操作过程。

许多研究尿液样品中分析物稳定性的研究都集中在尿浸膏（条带）分析，尿沉渣或细菌生长。已经进行了一些研究，以建立关于某些尿液分析物稳定性的证据。然而，由于这些研究的结果部分矛盾，并且大多数这些研究只研究了少量的分析物，我们旨在评估通常导致尿石症病因学和风险分层的所有实验室参数的稳定性。我们从10名志愿者中制备尿液等分试样，模拟24小时尿液样本，并在各种条件下储存（图1）。虽然所有样本都是从女性受试者身上取出的，但我们可以将这一事实排除在改变研究结果之外，因为我们的调查集中在酸化和储存条件上，而不是结果本身（例如性别之间的差异）。通过分析uCa，uMg，uP，uCrea，uOx，uUA和uCit，我们发现无论储存条件或持续时间如何，都没有统计学差异。这些发现与关于这个主题的大多数可用证据一致。 与我们的数据相反，Nicar等人发现uCa，uCit和uCrea水平显着下降。

从最多17个随机选择的24小时尿液样本中，未保存的与保存的样本中的草酸盐水平升高[34]。Kösem等人发现，在118例门诊患者到医院进行24小时尿液检测后，uP值在储存24小时和48小时后显著降低，但保存情况没有改善[26]。Van Gammeren等人研究了草酸盐添加和酸化对24个EQAS尿液样本和20个患者尿液样本中uCa恢复的影响。他们发现过量草酸盐的样品中的钙回收率降低，而酸化样品显示出良好的恢复性。在我们的研究中，钙浓度最高的参与者在草酸盐浓度为1.2 mmol / L时达到2.6 mmol / L，van Gammeren发现钙回收率降低80%。然而，直接比较具有挑战性，因为研究之间的草酸盐含量不同。欧洲尿液分析指南指出，uP、uOx 和 uCit 应酸化，uUA 应碱化以达到稳定性。文献中的其他几项建议也是如此（见表1）。

据说草酸盐浓度在长期储存期间会增加，这取决于储存的温度和持续时间以及样品中抗坏血酸的量，最终转化为草酸。霍奇金森建议用HCl保存尿液样本，因为草酸钙在未保留的尿液中迅速沉淀。Braiotta等人甚至在储存或测量前酸化时，在24小时尿液中观察到更高的草酸盐浓度。然而，我们的数据显示，当尿液在室温下储存长达72小时时，没有迹象表明需要防腐剂，这证实了Wu等人的发现，他们发现草酸盐在室温下稳定长达48小时。

这项研究也是为数不多的评估枸橼酸尿稳定性的研究之一。Wu等人观察到，当HCl添加到样品中时，柠檬酸盐浓度显着降低，与我们的数据形成鲜明对比，没有发现这种效应。然而，作者确实支持需要防腐剂来储存尿液样本以进行柠檬酸盐测量。Ferraz等人发现，与之前酸化的样品相比，收集后酸化的样品中的柠檬酸盐水平降低，但发现这些样品在临床上无关紧要。储存在BD管中的样品，含有丙酸钠和氯己定二乙酸盐作为防腐剂，结果与相应的参考样品和其他储存条件的结果相当。这一发现与Ercan等人的结果一致，他们报告说存储在这些试管中的样品中没有钙/草酸盐晶体的增加。前面提到的Kösem等人的研究也是使用BD防腐剂管进行的。为了保存尿液以进行uuA测量，大多数来源建议碱化步骤（表1）。然而，我们的研究表明，用于此类测量的样品可以在室温下储存长达72小时，这证实了L. Thomas教科书的陈述。

我们所有的研究结果表明，在24小时尿液收集期间不需要防腐剂，用于结石形成患者的代谢评估以及这些样品的储存长达72小时。鉴于其他研究的矛盾结果，我们还确定了我们研究中发现的最大偏倚是否具有临床意义。为此，我们绘制了所有分析物的最大偏差（与相应的参考样品相比，任何等分试样的最高正负偏差）与年龄调整后的参考范围相比（图3）。该评估清楚地表明，即使发现一个具有统计学意义的存储相关偏倚，这种偏倚也很可能没有临床意义。

图 3.临床相关性 灰色条形图描绘了不同年龄的参考区间。黑匣子（“最大差异”）表示与相关参考样本相比平均值的最大差值。参考值来源：Tietz临床化学和分子诊断教科书，第4版。[44].

Ferraz等人提出了一种非常实用的方法，他们研究了酸化前与酸化后对尿液成分的影响。他们发现，尿液样本的递送后酸化或碱化不会改变尿草酸盐，钙，镁，肌酐和尿酸的水平，并且柠檬酸盐的变化无关紧要。因此，可以在没有防腐剂的情况下收集24小时尿液样本，并且可以在检索时在实验室中等分试样，并在分析前根据需要酸化或碱化。值得注意的是，使用防腐剂如百里香酚或甲苯已被证明可用于防止细菌生长。

我们的研究有一些局限性。首先，我们没有包括任何来自抗坏血酸摄入患者的样本，其中由于体外氧化过程，预计草酸盐值会更高。然而，由于抗坏血酸会干扰几种试纸分析物的测量，建议患者在尿液收集之前或期间避免摄入大量维生素C产品[36]。其次，我们没有从成石器中收集样本。尽管如此，我们认为这并没有显着影响我们的结论，因为Ferraz等人在酸化前或酸化后找不到健康受试者和成石剂之间的任何差异[37]。最后，尽管可能性极小，但我们不能排除冻融循环（-70°C）对草酸盐，柠檬酸盐或尿酸测量的影响。

5. 结论

我们证明，与目前的指南建议相反，不需要特殊处理保存尿液来测量uCa，uP，uMg，uCrea，uOx，uCit和uuA作为结石患者代谢原因的指标。我们希望这些证据可以作为推荐更新的基础，并可能有助于结石前患者的24小时尿液收集。

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