泌尿大分子和糖胺聚糖在草酸钙结晶过程中与肾结石形成风险有关的作用

使用多方面基础科学方法，寻求泌尿大分子和糖胺聚糖在草酸钙结晶过程中与肾结石形成风险有关的作用的一致性

Dalielah Jappie, Allen Rodgers, Dawn Webber, Mayur Danny I. Gohel,

Seeking consistency for the role of urinary macromolecules and glycosaminoglycans in calcium oxalate crystallization processes pertaining to the risk of renal stone formation using a multi-faceted basic science approach,

Clinica Chimica Acta,

Volume 521,

2021,

Pages 76-84,

ISSN 0009-8981,

https://doi.org/10.1016/j.cca.2021.06.027.

(https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S000989812100228X)

Abstract: Background

The roles of urinary macromolecules (UMMs) in calcium oxalate (CaOx) renal stone formation have not been consistently established.

Aim

To unravel these roles using a multi-faceted, multi-technique approach employing a wide range of experimental variables on a rotational basis in strategically chosen combinations.

Methods

Endogenous urinary glycosaminoglycans (GAGs) were investigated in fractions obtained after ultrafiltration of pooled human urine (HU). Exogenous GAGs (chondroitin sulphate, CS, and hyaluronic acid, HA) were studied in artificial (AU) and in individual HUs. Experiments were conducted in a batch crystallizer and in a mixed suspension, mixed product removal flow system. Crystallization was quantitatively followed using Coulter multisizer and flow cytometer techniques. Crystal aggregation in the presence and absence of exogenous CS and HA was measured by Zeta potential and crystal sedimentation.

Results

Total UMMs (endogenous) and individual GAGs (exogenous) consistently promoted CaOx crystallization and disaggregation. Evidence of UMM-UMM and UMM-solution synergistic effects was consistently observed for achieving modulation of crystallization processes.

Conclusions

Total UMMs, the main modulatory component of which is GAGs, are promoters of CaOx crystal nucleation and inhibitors of CaOx crystal aggregation. These results allow researchers to disregard alternative roles that have been advocated in such studies.

Keywords: Urinary macromolecules; Urinary glycosaminoglycans; Modulatory role; Calcium oxalate crystallization 

•泌尿高分子首次通过多方法研究肾结石中的作用。

•结晶器，结晶介质，检测方法。

•大分子提高成核率，减少聚集，对生长无影响。

•大分子之间以及大分子与培养基之间协同作用的证据。

•推测涂层和块状机制，而不是化学结合机制。

尿大分子 （UMM） 在草酸钙 （CaOx） 肾结石形成中的作用尚未得到一致证实。目的  使用多方面，多技术的方法解开这些角色，在选择的组合中轮流使用广泛的实验变量。方法 在对合并的人尿液（HU）超滤后获得的分数中研究了内源性尿糖胺聚糖（GAGs）。在人工（AU）和个体HU中研究了外源性GAG（硫酸软骨素，CS和透明质酸，HA）。实验在间歇结晶器和混合悬浮液中进行，混合产品去除流动系统。使用库尔特多量仪和流式细胞仪技术定量地进行结晶。通过Zeta电位和晶体沉降来测量存在和不存在外源CS和HA的晶体聚集。结果 总UMMs（内源性）和单个GAG（外源性）始终如一地促进CaOx结晶和分解。在实现结晶过程的调制方面，一直观察到UMM-UMM和UMM溶液协同效应的证据。结论 总UMM，其主要调节成分是GAGs，是CaOx晶体成核的启动子和CaOx晶体聚集的抑制剂。这些结果使研究人员能够忽略此类研究中倡导的替代角色。

图形抽象

1. 引言

尿大分子（UMMs）多年来一直被认为是草酸钙（CaOx）结晶的调节剂[1]，[2]，[3]，[4]，[5]。通常，使用两种不同的方法对UMM进行了调查。在第一个真正的尿液中，通过过滤和超滤系统地去除其UMM含量，或者通过物理化学技术分离，并通过加入水溶液Na在整体和分馏部分诱导结晶2牛 [3]， [6]， [7]， [8]， [9]， [10]， [11].这使得研究人员能够研究内源性UMM的作用。在第二种方法中，将UMM（来自人类和动物来源）与Na一起添加到人造或真实尿液（整个或分馏）中2对Ox和结晶过程进行相应的表征[9]，[12]，[13]，[14]，[15]。这使得可以研究外源性UMM。尽管进行了大量研究，但UMM的一贯明确作用尚未出现。

尿糖胺聚糖 （GAGS） 也存在类似的病史，GAGS 是通用 UMM 组的一个子集。GAGs作为CaOx晶体和石头调节剂[1]，[2]，[12]，[13]，[14]，[16]，[17]，[18]而享有广泛的声誉，然而，与总UMM一样，许多涉及总和个体GAG的体外结晶研究未能为这类尿液大分子提供明确定义和明确的作用。这在Ryall [1]，[16]Khan和Kok [2] Aggarwal等人[19]的优秀评论中得到了很好的记录，并且在Boeve等人的一篇文章中[17]都提供了一系列研究，证明通过单个和总GAG抑制和促进成核生长和CaOx结晶过程的聚集。 这种缺乏可重复性和一致性归因于已采用的各种结晶系统和模型以及用于评估结晶过程本身的定量晶体监测技术[1]。事实上，我们之前已经提出需要一个标准的参考结晶系统[8]。

多样性在用于评估UMM从研究晶体形成过程的不同溶液介质开始的CaOx结晶调节的实验系统中是显而易见的（简单的水溶液人造尿液真实尿液）。已经使用了两种形式的真实尿液（个体和混合）。用于诱导结晶的不同模型，如批量晶种和MSMPR（混合悬浮混合产物去除）增加了多样性。最后，用于监测和量化结晶本身的技术差异很大（浊度计颗粒计数化学分析扫描电子显微镜），产生的结果通常取决于检测技术本身的相对灵敏度。

我们注意到，没有一项研究采用多方面的方法，在这种方法中，环境和条件在一系列战略性选择的组合中轮流变化。我们认为，这种方法可能会揭示高分子调节行为的一个共同点。因此，这被定义为本研究的目标。

2. 实验性

2.1. 初步测试

在开始研究的主要目标之前，我们进行了测试，以检查超滤冷藏和储存对尿液成分的影响。五名年龄组20-30岁的健康白人南非男大学生没有肾结石疾病史，每人提供一份24小时尿液样本。受试者在不含防腐剂的塑料瓶中提供尿液样本。通过常规尿液分析确定从超滤中获得的每个组分的组成（见下面的详细信息）。此外，将未处理的尿液的等分试样在4°C下冷藏3天，在此期间确定每天的组成。

2.2. 主要实验

进行了四组实验。根据我们的目标，采用了一系列模型和技术。这些建议总结在表 1 中。通过使用一系列不同的实验，我们能够探索UMM和GAGS的共同作用是否占上风。实验被分为两组。A组侧重于内源性UMMs的作用，而B组则研究了两种外源性添加的UMMs硫酸软骨素（CS）和透明质酸（HA）的影响。对于A组实验，采用超滤将真实尿液样品分离成FILT UF和CONC级分。在该组中进行了两项实验（实验1和2）。它们仅在用于表征表征过程的技术方面有所不同。在这些实验中，通过测量每单位时间内形成的晶体数量来确定动力学。我们使用合并尿液，因为实验需要大量的尿液。我们决定使用库尔特和流式细胞术分析进行颗粒计数和定量，其动机是我们的目标，即研究是否可以识别一致的调节作用，尽管使用具有完全不同工作原理的监测技术。

为了研究外源性添加的UMMS（B组实验），我们最初的策略采用简单的培养基（人造尿液AU实验3）而不是真正的尿液来确定在没有总UMM的情况下测试物质的调节作用。此外，使用人工尿液提供了研究MSMPR中流动动力学的机会，其可行性不如实际尿液更具挑战性[20]。

在本实验中，将稳态方程应用于库尔特多晶粒数据，使我们能够分别确定成核和生长速率，而不是像实验1和2中那样确定总体结晶速率[21]。它还允许确定与颗粒数直接相关的悬浮密度[12]。最后，在实验4中，我们在真正的尿液FILT UF和CONC中添加了两种市售的GAGS（参见下面关于外源性UMM的部分）。在这个实验中，我们使用单个尿液而不是合并的样本，因为它使我们能够在实验条件中引入另一个变化，以符合我们在不同泌尿场景中为UMM寻求一致调节作用的目标。

2.3. 受试者、尿液、混合

从年龄组20-30岁的健康南非白人男性大学生中收集了24小时的单次尿液，用于实验1（n = 54）和2（n = 48）。所有受试者都遵循他们的免费饮食。尿液检测呈血尿或亚硝酸盐阳性，被丢弃。根据我们实验室之前的一项研究，将每个实验中6名受试者的相等等分试样汇总，该研究表明，统计学上可靠的池至少需要6次尿液[22]。这在实验1和2中分别产生了9和8个池。过滤每个合并的尿液样本，然后按照我们的初步测试所述进行超滤，以产生FILT UF和CONC级分。

2.4. 尿液超滤

使用0.75μm预过滤器（PRE-FILT级分）过滤未处理的尿液（整个部分），然后使用0.45μm硝化纤维素过滤器除去细胞碎片（FILT分数）。此后，使用细胞系统以10 kDa的标称截止值（YM10膜Amicon公司）对FILT级分的等分试样进行超滤。使用氮气在电池（Amicon电池Amicon Corp.）内保持3.7个大气压的恒定压力。将初始体积为〜180ml的超滤产生〜120ml超滤液（UF级分）和〜60ml浓缩物（CONC级分）。

尿液分析

分析每种尿液（个体和合并）和每个部分（WHOLE，PRE-FILT，FILT，UF和CONC）的组成。常规测量尿量和pH值（pH计211 Hanna仪器）。钠钾钙和镁通过火焰原子吸收光谱法测定（瓦里安模型1275）。 使用酶试剂盒（Sigma Diagnostics）测定尿草酸盐，并使用柠檬酸裂解酶（勃林格曼海姆）通过UV方法测定柠檬酸盐。氯化物由离子选择性氯化物电极测定。使用钼酸铵（ Synchron LX Systems）测量无机磷， 使用uricase（Synchron LX Systems）测量尿酸，并通过与picric acid反应测量肌酐（Synchron LX Systems）。

2.6. 人工尿液

根据Kavanagh等人的方法制备AU[23]。将NaCl（160 mM BDH）、氯化钾（82.1 mM BDH）、硫酸铵（21.9 mM Merck）、氯化铵（3.5 mM BDH）、氯化镁（3.26 mM Sigma）、柠檬酸三钾（2.17 mM Saarchem）和磷酸二氢钠一水合物（50 mM Merck）混合制备了1 L溶液。我们用浓缩的HCl将pH调节至6.0。

2.7. 结晶实验

通过添加Na诱导所有尿液组分的结晶2牛（30 mM默克）和氯化钙2（150 mM Merck），并由Coulter multisizer监控。

2.7.1. CaOx 亚稳态极限

这被定义为草酸钠水溶液的最小量（Na2诱导CaOx结晶所需的Ox根据Ryall等人描述的方法测定[24]。用15μl Na短暂连续15ml等分试样被测尿液样品给药2浓度增加的牛（范围0.00至0.195 M，并在37°C的烘箱（Memmert）中孵育30分钟。在孵育期之后，使用配备140μm孔口的Coulter multiizer III（贝克曼Coulter USA）测量总颗粒数和体积，该孔口能够检测2.9-90μm尺寸范围内的颗粒。

2.7.2. CaOx结晶动力学

根据Ryall等人描述的方法确定总结晶速率（定义为成核生长和聚集的组合速率）[24]。1毫升剂量的Na2将对应于30mM以上的先前测定的CaOx MSL的Ox溶液加入到100ml尿液中以诱导结晶，并将尿液在37°C下在振荡水浴（Labcon）中以100rpm孵育。使用库尔特多发器以10分钟的间隔记录粒数体积和大小，持续90分钟。构建粒子数与时间的关系图，并采用图线性部分的梯度作为结晶速率的测量。

2.7.3. 外源性UMM

CS（Sigma-Aldrich）和HA（Seikagaku Corporation）分别来自牛气管和公鸡梳子，在商业上获得。选择CS和HA进行研究的理由是基于几个因素。两者都是无机溶液中CaOx结晶最有效的抑制剂之一[2]。CS已被证明在CaOx结晶中起多种（不同的）作用[16]。它是尿液中含量最丰富的GAG[2]，[4]，[5]，[17]。此外，GAG抑制活性的主要部分与CS [25]，[26]有关。

我们决定使用透明质酸作为测试物质之一，是因为它是唯一未硫酸盐的尿液GAG[25]，[26]。这很重要，因为GAGS的抑制活性取决于硫酸化的程度[18]。抑制剂效应的发生是由于硫酸化GAG与晶体表面的可逆结合，从而进一步的晶体生长和聚集被阻塞[18]。我们推断，使用透明质酸将使我们能够消除这种性质的抑制机制。

混合悬浮液混合产品去除结晶器（MSMPR）

本研究中使用的MSMPR系统在前面已经完全描述过[12]。实验在香港理工大学进行，涉及一对相同的结晶器，其中一个用作对照室，另一个用作试验室[12]。该实验运行了6-8个停留时间，此时已经实现了稳定状态（动态平衡），如粒度分布所证实的那样。在此期间，来自腔室的混合产品被收集在废物容器中。在稳态下除去混合产物，并使用库尔特Multizer III以一式三份测量每个腔室中的粒度分布。构建了Ln N（晶数）与L（晶粒）的曲线，并利用稳态原理分别从梯度和截距计算了生长速率（G）和成核速率（B）[21]。

2.7.5. 外源添加的UMM对晶体聚集的影响。

（一）

泽塔电位（ZP）

ZP是胶体颗粒与其周围溶液之间表面的电势[27]。带负电荷的UMM与COM晶体表面结合。这诱导了高度负的ZP，在涂有umMM的颗粒之间引起排斥力。因此，晶体聚集被减少。[28]， [29]， [30].因此，ZP的增加在石材研究中被广泛认为是抑制晶体聚集的。

该方法已在别处描述过[31]。根据Pak等人的方法制备测定所需的草酸钙一水合物（COM）晶体[32]。通过X射线粉末衍射和热重分析实现了晶体作为100%一水合物的验证。ZP测量是使用Zetasizer Nanoseries（Malvern Instruments）一式三份进行的。

（二）

晶体沉淀

根据Hess等人开发的沉降测定法测定CaOx晶体聚集的抑制作用[30]，[33]。在该方法中，将含有被测UMM预设浓度的COM晶体浆料在分光光度计（Specord 40 Analytikjena Germany）的玻璃比色皿中搅拌过夜。在620nm处监测吸光度，直到达到平衡，这通过10秒的稳定读数来证明。停止搅拌器并观察到吸光度的降低。由于平衡溶液不允许任何进一步的生长或溶解，吸光度的降低是由于颗粒的沉降与其聚集程度有关[33]。吸光度与时间图的线性截面的斜率是此聚合范围的度量。聚集抑制的百分比是根据Hess等人推导的方程确定的[33]。

2.7.6. 统计分析

使用GraphPad Instat版本3.06（GraphPad Software San Diego USA）分析了为初步测试和确定MSL收集的数据的统计显着性。应用了带有韦尔奇校正的参数化不成对 t 检验。p≤0.05的数据被认为有显著差异。所有数据均以平均值±SE（标准误差）表示。使用GraphPad Prism版本4.03和Instat 3.02（Graphpad Software San Diego USA）对动力学数据进行了统计分析。通过线性回归测试了Ln（N）图相对于晶体尺寸的斜率和y截距。所有报告的发现均为线性图，具有高r2（>0.95）表示实际的生长和成核速率，而不受晶体聚集的影响。采用单因素方差分析（方差分析）对不同浓度CS HA UMM与对照组的均值差值进行对比。p <0.05的值被认为具有统计学意义。所有重要的方差分析测试结果均在测试后通过Dunnett的多重比较进行分析。

2.7.7. 伦理

该研究获得了开普敦大学人类与健康科学研究伦理委员会（HREC 381/2013）的批准。所有程序均按照开普敦大学的道德标准和《赫尔辛基宣言》执行。该研究的每位受试者都获得了知情同意。

3. 结果

3.1. 初步测试

与彼此相比，任何部分尿液成分都没有显着变化。同样，在3天的冷藏期间，整个级分的组成也没有变化。这些结果表明，尿液的非大分子组成及其在4°C下的制冷不受超滤的影响。这些结果与之前报告的结果一致。

内源性UMM对真实尿液中CaOx MSL的影响

在实验1和2中测定了CaOx亚稳性的上限。这些实验仅在用于检测和计数颗粒的技术（库尔特和流式细胞术）方面有所不同。颗粒数与添加钠浓度的关系图2Ox分别在图1a和1b中给出。这些结果表明，馏分间CaOx MSL值无显著差异。两种计数技术均产生相当的MSL值（0.51和0.41 mmol/l Na）2分别是牛）。

1. 图 1.颗粒数与添加钠浓度的关系图2用于测定CaOx MSL的Ox。

内源性UMM对真实尿液中CaOx结晶动力学的影响

为了研究内源性UMMS（>10kD），在实验1和2中测定了总结晶速率。与颗粒数一样，这些实验仅在用于检测和计数颗粒的技术（分别为Coulter和流式细胞仪）方面有所不同。在这两个实验中，UF中的结晶速率与FILT和CONC级分中的结晶速率进行了比较。结果如表2所示。

表 2.尿液级分中的总体结晶速率（否粒子/分钟）使用不同的粒子计数技术。

*p = 0.0062;■p = 0.0388;Φp = 0.0501。

其共同特征是遵循UF<FILT序列的结晶速率，表明UMMS>10kD是成核的启动子。

外源添加CS和HA的效果如表3所示

表 3.商业来源的动物GAGs对AU中的CaOx成核和生长速率以及使用不同结晶器的真实尿液中整体结晶速率的影响。

♦非盟的基线被视为非盟本身;取真实尿液基线作为UF分数。

可以看出，结晶速率遵循UF<FILT序列，表明UMMS>10kD是CaOx成核的启动子。外源添加CS和HA对人工成核和生长速率以及真实尿液整体结晶速率的影响这些结果（实验3和4）如表3所示。

实验3表明，当单独添加CS和HA时，AU中的成核速率增加。这证实了实验1和2中的结果，表明>10kD的大分子是CaOx成核的启动子，尽管这些结果是在总UMM中观察到的，而实验3中的结果是针对两个单独的UMM。鉴于实验3中的条件与实验1和2中的条件在几个方面有所不同（人工与真实尿液;个体尿液与混合尿液;msmpr与批量结晶器）。因此该协议值得注意。有趣的是，当两个UMM组合添加时，没有效果，这表明一个潜在的负面协同效应的例子。我们在本文件的“讨论”部分对此提出评论。

我们注意到，非盟的增长率在仅存在CS的情况下没有变化，但在存在HA的情况下却有所下降。有趣的是，在HA + CS的存在下，它增加了，与上一段中描述的发现类似，我们将其归因于可能的协同效应。

两种外源性UMM均不影响真实尿液中的结晶速率（Expt 4）。

内源性UMM对颗粒数的影响

结果在表4中给出。这些结果表明，UF中90分钟的颗粒数<FILT。这表明UMMS（>10kD）是CaOx晶体形成的促进剂，并证实了我们上述动力学实验的结果。同样重要的是，库尔特和流式细胞仪计数技术观察到了相同的颗粒数发现。

表 4.用Na给药后90分钟尿液中颗粒总数。

*p = 0.0016;♦p = 0.0007;Φp = 0.0161;

Ω流式细胞术数据所示的最小颗粒数据。

3.6. 外源UMM对粒子数量的影响

结果在表5中给出。据观察，当CS和HA单独和集体添加到AU中时，颗粒数量显着增加，表明这些UMM促进了成核。然而，两种外源性UMM都没有影响真实尿液中的总颗粒数（实验4）。

表 5.商业衍生的GAG对使用不同结晶器的AU和真实尿液中颗粒总数的影响。

♦外源添加的UMM对悬浮密度的影响如图2所示。

图 2.加入CS和HA之前和之后AU中CaOx晶体的悬浮密度 （实验3）。

1. 图 3.每个尿液部分的平均颗粒体积与大小的关系图（实验1）。

图2表明，相对于AU，CS和HA的存在单独和集体地诱导了颗粒悬浮密度的显着增加。CS和HA的效果是相等的和累加的。不出所料，这些结果与粒子数的结果一致。

内源性UMM对颗粒体积和尺寸的影响

实验1中总UMM对总颗粒体积和尺寸的影响如表6所示，图2示出。在总UMM存在的情况下，总颗粒体积增加。平均晶体尺寸保持不变。表 6.在实验1中，通过库尔特计数器（n = 9）测量的FILT UF和CONC分数的总颗粒体积和平均粒径。

在实验2和3中没有确定总颗粒体积和平均粒径。在实验4中，外源添加的UMM对颗粒总体积或大小没有影响。

3.9. 外源UMM对CaOx晶体聚集的影响

（一）泽塔电位

COM晶体的ZP值作为CS和HA浓度的函数分别在图4a和4b中示出。值随着每个 UMM 浓度的增加而降低。在没有修饰符的情况下，ZP为-13.4 mV。该图显示，每个UMM的孵育增加了负表面电荷的大小。如本文前面所述，由于排斥晶体间力[17]，[33]，[34]，[35]，向更负ZP的转变表明分解。

（二）沉降

图 4.COM晶体ZP的变化是（a）CS和（b）HA浓度的函数 。

CA和HA聚集的平均百分比抑制分别在图5a和5b中示出。这些显示随着GAG浓度的增加，聚集抑制的增加。HA显示的聚集抑制百分比（30.0%）大于CS（22.9%）。我们在“讨论”部分对此提供评论。

图 5.COM晶体聚集的抑制百分比的变化作为（a）CS和（b）HA浓度的函数。

4. 讨论

      在评估我们的结果时，我们采用了一种算法，当在两个或多个实验中证明UMM的相同调节作用时，这些实验本身至少存在一种性质（结晶器结晶介质检测技术外源/内源性UMM），它可以被定义为“一致”。 另一个重要的考虑因素是澄清过滤和超滤后获得的尿液分数的组成。Borghi等人证明，过滤（0.22μm）导致THM浓度显着（但不完全）降低[3]和GAG浓度适度降低[3]。在后来的一项研究中，Maslamani等人证明过滤减少了蛋白质和脂质的量[36]。铃木及其同事的一项研究显示，UF之后不存在GAG[10]。我们没有在任何泌尿部分应用GAGS或UMM的化学分析，但基于上述研究，我们对成分边界做出了以下假设：滤过后分数（FILT）含有少量THM +那些不经历聚合和絮凝+ GAGS的尿蛋白;超滤液级分（UF）不含任何GAGs或其它UMMs[3]，[10];截留物或浓缩级分（CONC）含有总UMM>10kD，其中糖蛋白THM GAGS亲水性胶体磷酸肽酸肽类rNA样物质[3]，[18]。由于与CaOx抑制作用相关的主要UMM是THM和GAGs[12]，并且由于大多数THM通过过滤[3]去除，因此[37]我们采用了这样一个前提，即CONC组分观察到的任何调节活性都可以（主要）归因于GAGs。此外，由于CS是尿液中最丰富的GAG[2]，我们假设正是这种特殊的GAG控制了CONC分数的调节。

     我们发现，在实验1和2中，CaOx MSL不受总UMM的影响，这些UMM本身仅在粒子计数技术方面有所不同，这为这一结果提供了信心（图1a和1b）。因此，我们认为这是一个一致的发现，表明总UMM不会对CaOx结晶施加热力学调节作用。

     另一方面，我们确实观察到调制效应涉及实数和AU中结晶过程的几种动力学性质。其中包括我们的发现（表2），即使用Coulter（实验1）和流式细胞术（实验2）技术，总UMM增加了颗粒数量并促进了CaOx结晶的总体速率。在稳态MSMPR结晶器中使用AU发现了相同的结果（实验3）。在这个实验中，结果表明，受影响的特定结晶机理是成核。除了本身就是一个重要的发现之外，令人鼓舞的是，它与实验1和2中的发现一致，因为实验条件在测量结晶的介质（AU与真实尿液）和结晶系统的性质（批次与MSMPR）方面各不相同。同样重要的是，实验3中的调节是通过两个单独和集体地外源添加GAG来实现的，从而支持了这样一种观点，即在没有THM的情况下，UMMs的抑制电位与GAGs一起存在，后者的大部分已被过滤除去[3]。

     有趣的是，在AU实验中发现的所有实验都涉及商业获得的GAGS（CS和HA;表2 5和6）显示，它们促进CaOx结晶与先前的研究结果一致[12]，并证实了我们在实际尿液实验1和2中涉及内源性UMM的发现。支持这一概念的进一步证据来自我们的悬浮密度测量。此变量是粒子数的度量。我们观察到它在CS和HA存在下增加（图3）支持我们在其他实验中的发现，即UMM促进CaOx晶体成核。先前已经观察到CS的悬浮密度增加[12]。

      重要的是，由于成核和结晶（小晶体的快速形成和过饱和度的快速降低）被解释为降低结石形成的风险[16]，我们认为将总GAG分类为潜在的CaOx结石抑制剂是合适的。然而，人们需要记住，我们（以及其他人[16]）的论点是，小晶体的成核降低了结石形成的风险，这取决于它们从泌尿道中迅速消除。可以认为，如果不发生这种情况，其中一些可能会保留在肾腔中，并经历外延生长和异质成核成形，形成更大的实体，这将增加结石形成的风险。但是，GAG有能力发挥额外的保护作用，从而缓解这种情况。首先，它们涂覆晶体并赋予其表面负电荷。这些诱导晶体细胞排斥力，降低晶体保留的可能性[38]，[39]。其次，尽管没有任何研究证明外延本身的外延和毛层机制，但很容易设想并且完全合理地期望这确实发生。

     我们的发现，在总UMMS的存在下，总颗粒体积增加（表6图2）值得评论。颗粒体积的增加可能来自三种不同的机制 - （i）通过成核增加颗粒数量（ii）通过生长增加颗粒尺寸和（iii）通过分解增加颗粒数量。通过我们的观察，颗粒尺寸没有变化，可以排除生长的增加（表6图2）。我们在实验3中的观察结果，CS和HA都抑制聚集（相当于促进分解）为观察到的颗粒数量增加提供了另一种解释。此外，使用两种不同的技术（Zeta电位和沉积;图3，图4）使这成为另一个一致的发现，这使我们能够表明抑制CaOx聚集是另一个可能的作用CS和HA以及总GAG。

     有趣的是，我们发现HA显示的聚集抑制百分比（30.0%）大于CS（22.9%）。鉴于HA是一种非硫酸化的GAG，该结果表明硫酸盐基团结合以抑制聚集并不是实现这种效果的唯一机制。也许HA具有可行的非硫酸盐结合位点。例如，在试图解释为什么在HA Aggarwal不存在的情况下CS被掺入CaOx晶体中时，同事们建议它们可能在晶体表面上竞争相同的结合位点[19]，从而暗示HA上存在活性结合位点。对两种UMMs的结构式的检查[12]表明，HA中存在OH基团（因此作为潜在结合位点的可用性），由于它被硫酸盐基团取代而不存在于CS中。对HA晶体结合能力概念的进一步支持在Verkoelen等人的一项研究中提供[40]。另一方面，HA可以通过简单的涂层和阻滞机制对其聚集施加抑制作用。事实上，Shum等人推测，像HA这样的高分子质量物质会覆盖晶体并阻断它们之间的相互作用[11]。

聚集被广泛认为是CaOx结石形成的关键危险因素[41]，[42]。虽然外延也被提出作为晶体生长的机制[43]，但关于它在这方面的作用一直存在很多争论[44]，[45]。在本研究中，我们没有测量外延本身，但我们相信，我们发现GAG抑制尿晶体聚集，这足以证明我们声称这组分子是结石形成的潜在抑制剂。

    本研究的一个关键发现是，CS和HA对真实尿液中CaOx的任何结晶特性没有单独或组合的任何影响（实验4）。这与前一段中描述的实验1和2（真实尿液）以及实验3中的结果相冲突。这是令人失望的，因为实验1和2从真实尿液中去除了UMM，这为这些UMM的调节作用提供了令人信服的证据。对于这种异常，有几种可能的解释。其中之一是，简单地将两个GAG添加到真实尿液样本中并不能模拟总UMM的存在。这表明UMM可以集体行动以产生调节效应。“整体大于其各部分的总和”的陈词滥调可能是有道理的。

    另一方面，本研究中使用的CS和HA样品可能与真实尿液中发生的CS和HA在某些方面（组成构象结构）不同。本研究中的CS来自牛气管，而HA来自公鸡梳。事实上，以前已经报道过，来自非人类和非肾脏来源的市售GAG可能与泌尿环境中的GAG不同[6]。

最后，UMM与其居住的泌尿环境之间可能存在密切的协同作用。我们在之前的一项研究中为这一假设提供了证据[46]。UMM本身之间不涉及亲本尿液的协同效应的概念以前也曾被提出过[7]，[12]，[26]。事实上，本研究已经提供了CS和HA相互作用对实验3中成核和生长机制的这种影响的证据。

     我们认为，CS和HA是CaOx晶体聚集的抑制剂的发现是一致的，因为这种效应已经使用两种根本不同的技术（Zeta电位和晶体沉降）得到证明。

     总之，我们已经实现了利用尽可能多的结晶变量的目标，以探索GAG和UMM在调节与肾结石形成相关的CaOx结晶危险因素中可能存在的一个或多个一致作用。结果表明，总UMM是CaOx成核结晶的启动子，也是CaOx晶体聚集的抑制剂。虽然这些发现证实了许多其他研究的结果，但我们相信，由于它的设计，我们的研究允许研究人员排除在此类研究中倡导的替代角色。

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