邓绍平 | 异种移植新进展:从实验到临床

2022
06/04

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中国普外基础与临床杂志
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2022年 1月 7日美国马里兰大学医学中心报道了全球第 1例基因编辑猪心脏成功移植到 1例 57岁患有终末期心脏病的男性患者体内,引起了全球轰动。

异种移植新进展:从实验到临床

李丹妮,赵艳双,王轶,潘登科,邓绍平. 异种移植新进展:从实验到临床. 中国普外基础与临床杂志, 2022, 29(6): 705-710. doi:10.7507/1007-9424.202204023

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邓绍平

主任医师,电子科技大学附属医院 . 四川省人民医院器官移植研究所研究员,博士生导师。1990 年于瑞士日内瓦大学外科从事临床及科研工作并获得临床医学博士学位,主攻器官移植方向;1995 年于美国宾夕法尼亚大学外科做博士后科研工作,致力于移植免疫学的基础研究以及基因治疗在器官移植和糖尿病防治方面的应用研究。完成博士后研究后,分别在美国宾夕法尼亚大学医学院人胰岛移植实验室,美国哈佛大学医学院附属麻省总医院,担任麻省总医院外科副教授,胰岛植中心主任,开创临床胰岛移植治疗糖尿病的新试点。归国后,先后担任四川省人民医院副院长、院长。致力于推动医院器官移植研究所和器官移植中心的成立,并建立器官移植与临床免疫转化医学四川省重点实验室。在科研学术上,先后共主持国际合作项目 5 项,国家级科研项目 3 项,省部级科研项目 9项,厅市级科研项目 20 余项,申请立项经费超过 4 000万。在 Nat Med、Diabetes、J Immunol、Am J Transplant、Nature genetics 等国际知名杂志发表科研论文 200 多篇,北大核心论文超 20 余篇,总引用次数 10 000 余次,总影响因子超 500。荣获成都市科学技术进步二等奖,第十批四川省学术和技术带头人,并成为全球第一位当选国际异种移植学会常委的中国人。

摘  要

2022年 1月 7日美国马里兰大学医学中心报道了全球第 1例基因编辑猪心脏成功移植到 1例 57岁患有终末期心脏病的男性患者体内,引起了全球轰动。基因编辑猪心脏移植到人体内成功存活 59 d 而没有出现早期排斥,迈出了异种器官移植走向临床的关键一步。笔者重点探讨了基因编辑在减轻免疫排斥反应中的作用,总结了本次马里兰医学中心异种心脏移植案例,并且对异种移植现状以及异种移植尚未解决的问题进行了概述,期望未来异种移植能成功走进临床。

异种移植是将动物来源的活细胞、组织、器官以及体液移植入或输注到人类受体中。异种移植的发展动力源自临床移植的人体器官供应严重不足[1]。在美国,2020年进行了 3.9万例器官移植手术[2],在中国 2020年进行了 1.8万例器官移植手术,因得不到救命器官捐献而死亡的患者更多。器官捐献难以满足现阶段需要器官移植的患者数量,异种移植是解决器官短缺的重要途径。 

2022年 1月 7日美国马里兰大学医学中心报道了全球第 1例基因编辑猪心脏成功移植到 1例 57岁患有终末期心脏病的男性患者体内,引起了全世界的关注。马里兰大学心脏外科团队进行首次猪到人心脏移植而没有出现早期排斥迹象,创造了异种移植的历史,异种移植也因此走进了大众的视野。未来异种移植的临床应用将为全球每年在等待供体器官的患者提供一种潜在的解决方案。笔者拟简要讲述本次马里兰医学中心异种心脏移植案例,着重介绍基因编辑在减轻免疫排斥反应中的作用。 

1  全球首例基因编辑猪心脏移植到患者体内

据马里兰大学医学中心报道[3],全球首例接受猪心脏移植是一位患有终末期心脏病的 57岁男性,在 2021年 10月就医时只能卧床,在手术前 2周多依靠呼吸机(extracorporeal membrane oxygenation, ECMO)维持生命,随时都可能死亡。首先,由于该患者长期酗酒且不遵医嘱,不能被纳入同种心脏移植名单内;其次,该患者伴有严重的心律失常也不符合做人工心脏的要求;因此唯一延长生命的办法是接受猪心脏移植。虽然异种器官移植技术还没有获得许可投入使用,但美国食品和药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)有“同情使用”(compassionate use)条款,当患者面临严重或危及生命的医疗状况,且仅有实验性疗法这一种选择的时候,就适用这项条款。基于这些重要原因,马里兰大学医学中心遵照“同情使用”条款和该患者的意愿,最终促成了该患者移植猪心脏的壮举。在 2022年,当地时间 1月 7日,经 FDA批准,美国马里兰大学医学中心的外科医生团队成功将一颗基因编辑猪的心脏移植到了该患者体内。

据马里兰大学医学中心披露,该患者的供体心脏来源于 10基因编辑猪,涉及的基因总结为 3类:一是敲除激活人天然抗体的 3个糖基化抗原基因 α-1,3-半乳糖基转移酶(alpha-1,3-galactosyltran-sferase,GGTA1)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH)和 β1,4N-乙酰半乳糖胺基转移酶(β1,4N-acetylgalactosaminyltransferase, βGalNT2);二是转入 6个减轻排斥反应和保护作用的人源基因 CD46、 CD55、血栓调节蛋白(thrombomodulin,TBM)、内皮细胞蛋白 C受体(endothelial protein creceptor,EPCR)、CD47和血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1);三是敲除生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)基因。得益于基因编辑技术的不断发展,才能完成这 10项基因编辑,力求最大限度地保证这颗心脏在人体内长期存活。该患者接受了移植基因编辑猪心脏的手术,手术后心脏状况良好,没有出现立即的排斥反应。根据马里兰大学医学中心研究人员表示,患者手术后很快苏醒,术后第 4天去掉了 ECMO,这颗心脏能达到正常人心脏的功能,猪心脏的血流量和压力符合人体血液循环动力学要求,没有出现超急性排斥反应,该患者存活了 59 d。患者术后经历了一系列并发症以及多次手术,在最后一段时间出现感染和多器官衰竭问题,患者病情逐渐恶化,于 2022年 3月 8日去世[3]。马里兰研究人员正在进行彻底的检查分析,其具体的死亡原因以及是否有排斥近期将于正式的文章中进行发表。尽管该患者仍然没能依靠这个移植心脏延续更长久的生命,但基因编辑的猪心脏移植仍旧创造了医学奇迹,为下一步临床试验提供了宝贵经验。 

2  异种移植的免疫排斥

2.1 异种移植的免疫排斥机制

异种移植的最大难题是免疫排斥,首先面临的是超急性排斥反应。超急性排斥存在于异种移植间,能在 24 h内将移植器官、组织或细胞杀死,其原因是激活了人体存在于血液中的天然抗体[4]。血液中的天然抗体与异种移植物表面抗原结合激活补体系统。人体补体系统是由无数补体蛋白构成的复杂系统,包括 3条途径:经典补体通路、替代补体通路和凝集素补体通路。最终激活的补体通路会借助膜攻击复合物导致移植失败。其次是急性排斥反应,与人体同种移植类似,一般发生在移植后数日至 6个月内,人体特异性和非特异性免疫细胞如 B细胞、T细胞、巨噬细胞和细胞杀伤因子均参与到急性排斥过程中。最后是慢性排斥反应,虽然这方面的研究还不多,但是至少异种移植物被认为可能会经历同种异体相类似的慢性免疫排斥。所以,异种移植后患者需要接受综合免疫抑制治疗,以有效抑制复杂的免疫排斥反应。

2.2 免疫抑制剂

最早的异种移植开始于 1905年,法国医生布兰斯多将兔肾切成薄片植入肾功能衰竭儿童体内, 16 d后儿童死于肺部感染[5]。直到 1960年,免疫抑制剂的出现,为异种移植带来了新的火种。希钦斯和埃利昂两位科学家分离出一种强有力的免疫抑制剂“硫唑嘌呤”[6];1978年,环孢素首次应用于临床肾移植,以后又用于肝、心、肺、胰腺、骨髓等器官移植,均取得令人满意的效果;他克莫司(FK506)是钙调磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitor,CNIs)的一种,在 20世纪 90年代应用于临床;基因工程的进展带动了单克隆抗体和生物制剂的发展。所有这些免疫抑制剂都用在了异种移植基础实验中,并取得了较好的效果。当然,异种移植技术的突破不止在基因编辑方面,还包括新型免疫抑制。特别是抗 CD40抗体的出现,2016年 Mohiuddin等[7]报道了使用抗 CD40抗体的方案,基因编辑猪的心脏在狒狒体内最长存活了 945 d。在马里兰医学中心异种心脏移植案例中,也使用了抗 CD40抗体,该药物目前处于临床二期试验阶段。免疫抑制剂的药物优化,是确保异种移植成功的条件,但仅仅是免疫抑制剂也难以完全阻止严重的免疫排斥。 

2.3 针对免疫排斥反应进行基因改造

对于超急性排斥反应直到转基因技术的出现才有了更好的解决方案。研究者 [8]发现,猪血管内皮存在的特定表位 α-1,3-半乳糖抗原(α-galactose, α-Gal),会与人体血液中天然抗体结合,激活补体系统引起超急性排斥反应,所以避免超急性排斥反应的方法之一是灭活编码 α-1,3-半乳糖苷转移酶(alpha-1,3-lactosyltransferase,GGTA1)基因。2002年,Lai等[9]利用同源重组技术成功培育出 GGTA1单等位基因敲除猪,然后培育出GTA1双等位基因敲除猪(GTKO)。Diswall等[10]报道 GTKO猪心脏移植到狒狒体内,检测到狒狒血清与 GTKO猪心脏组织中的抗原结合减少,排斥减轻。随着基因编辑技术的出现和不断成熟应用,研究者逐渐可以对供体器官进行多个抗原基因的敲除,包括敲除其他能引起急性排斥反应的糖基蛋白抗原:由 CMAH 合成的 N-乙酰神经氨酸(Nglycolylneuraminic acid,Neu5Gc)和由猪 βGalNT2制成的 Sd(a)样聚糖。马里兰医学中心异种心脏移植案例的异种供体心脏中就是敲除了上述 3个能引起超急性和急性排斥的糖蛋白基因抗原。

2.4 转入人类补体调节蛋白

敲除猪的几个抗原只是遏制了猪血管内皮上的主要抗原与人体天然抗体的结合,不能完全避免补体系统的激活。在补体系统中存在天然的补体抑制因子:膜辅因子蛋白(membrane cofactor proteinCD46, hCD46)、衰变加速因子(decay-accelerating factor, hCD55)和膜攻击复合物抑制蛋白(membrane attack complex inhibitor protein, hCD59)。这 3类因子可以抑制人补体系统 3条通路的激活,其中 hCD46和 hCD55抑制 C3和 C5转化酶的形成,hCD59可以抑制攻膜复合物的形成。由于猪补体抑制因子的同源性差异,不能很好抑制补体的激活,所以需要转入人的补体抑制因子抑制补体的激活。2004年,Ignacio Anegon团队[11]培育了高表达人 CD46转基因猪,并将其肾脏移植到狒狒中,很好地抑制了超急性排斥反应,能很好地抑制补体激活的经典通路和替代通路。2012年 Mohiuddin等[12]报道了将 GTKO/hCD46转基因猪心脏移植到狒狒中,在抗人胸腺淋巴细胞球蛋白(anti-thymocyte globulin,ATG)、抗 CD154和霉酚酸酯(mycophenolate mofetil,MMF)的免疫抑制方案的背景下,基因编辑后的猪心脏有效减轻了免疫排斥,延长异种心脏的存活时间至 236 d。 

2.5 抗血栓基因

心脏、肾脏等实质器官移植时,当异种移植物移植给受体,随着血液的再次流通,因分子不相容导致的急性血管排斥反应(acute vascular rejection, AVR)在移植后几天至几周内发生。由于移植物内皮细胞激活后,造成炎症、纤维素沉积和血小板凝集导致移植物坏死或丢失[13],是猪到灵长类异种实质性器官移植的主要障碍之一[14]。研究[15]证明在猪中过表达 1个或多个人的抗凝基因,器官移植后可以明显抑制血小板聚集,显著延长移植物的存活时间,例如人 TBM、EPCR、CD39等。2016年 Mohiuddin等[7]人报道了 GTKO/hCD46/hTBM猪的心脏移植到狒狒体内,最长存活了 945 d,其中 TBM起到了重要作用。此外,表达 EPCR 也可能提高 TBM的抗血栓作用的相关研究也正在进行中。 

2.6 抗巨噬细胞和凋亡的基因

异种移植物进入受体后将被受体巨噬细胞清除,其主要原因是巨噬细胞表面的受体信号调节蛋白 α(signal-regulatoryprotein,SIRPα)不能特异性地识别异种细胞表面的整合素相关蛋白 CD47(integrin-associated protein,IAP),导致移植物细胞被受体内的巨噬细胞吞噬并清除。猪肾小球中人 CD47的表达可预防蛋白尿并延长猪至狒狒异种移植后的移植物存活时间。在肾小球细胞上高表达 hCD47的 GTKO/hCD47肾脏移植物的蛋白尿水平最低[16]。表达人血红素加氧酶-1(heme oxygenase 1,hHO-1)可以有效抵抗细胞凋亡,有助于克服缺血性灌注和移植后的凋亡。

因此,基于基因编辑猪在临床前试验中的大量结果,马里兰医学中心异种心脏移植案例的异种心脏中研究者使用了敲除 3个抗原,转入了 6个人源性的免疫调节和保护基因,以帮助猪心脏能更好地被人体免疫系统接受。

2.7 生长激素受体基因

马里兰医学中心异种心脏移植案例移植的供体器官猪属于大型猪品种,器官比人体的要大很多。大型猪是主要肉食品种,由国外选育而成。早期培育器官供体猪时选择大型猪,可能没有考虑器官大小适配问题。研究发现生长激素受体( growth hormone receptor,GHR)缺陷型猪,其血浆胰岛素样生长因子 1(insulin-like growth factors,IGF1)水平较低,出生后身体和器官生长显著受限。敲除 GHR后,体型变小。因此,生长激素受体敲除(growth hormone receptor knockout,GHR-KO)也被用在了该患者的器官供体猪的基因编辑中,使心脏大小和人体更加匹配。而我国有着丰富的小型猪资源,选择小型猪作为器官供体,就不需要敲除 GHR,中国的异种器官移植团队多选择中国特有的小型猪作为器官供体进行基因改造,如巴马小型猪、五指山小型猪等。

马里兰医学中心异种心脏移植案例移植的基因编辑猪心脏集合了异种移植发展史上所有的技术结晶,尽管该患者的基因编辑猪心脏移植只是异种移植未来“万里长征”的第一步,但仍旧鼓舞了探索异种移植发展的研究者。 

3  异种移植临床研究现状

美国的异种移植水平世界领先,特别是马里兰大学医学中心首次将基因编辑猪心脏应用在了临床研究中,没有任何成功是一蹴而就的。这次美国异种移植能成为世界首次,与他们前期进行了大量临床前试验密切相关,在近 5年内开展了 50多例猪到狒狒的临床前实验。在全球首例猪心脏移植成功之前,另美国移植团队已经成功进行了 3例基因改造猪肾脏到人体的移植。

第 1例是 2021年 9月美国纽约大学朗格尼健康中心 Montgomery教授团队[17],成功将基因改造过的 GTKO猪肾脏移植到脑死亡患者大腿和腹部外侧的血管上,并覆盖有保护罩;猪肾脏移植到人体内,没有立即出现排斥反应;据报道猪肾脏“几乎立刻”开始产生尿液和排泄废物肌酐,这是肾脏功能良好的标志。猪肾脏在与患者血管相连后,正常工作了 54 h。

第 2例是 2021年 12月,同一团队[18]将 GTKO猪肾移植到另一位靠呼吸机维持的脑死亡全身捐赠者身上。该例手术标志着潜在替代性器官应用领域的又一次进展。

第 3例是 2021年 9月阿拉巴马大学伯明翰医学院 Locke教授团队[19]对 1例脑死亡患者进行了双侧原发性肾切除术,随后将基因编辑猪肾脏移植入体内,再灌注期间血流动力学稳定,试验进行了 74 h;在移植期间未观察到超急性排斥反应和猪逆转录病毒的嵌合或传播;供体肾来源于 Revivicor提供的基因工程猪,包括两种补体抑制基因(hDAF、 hCD46)、两种抗凝血基因(hTBM、hEPCR)和两种保护基因(hCD47、hHO-1),以及敲除 3个猪糖基抗原和猪生长激素受体基因。

国内异种器官移植的研究也走在国际前沿。湘雅医院王维团队[20]发表了 2019年版异种胰岛移植临床研究专家共识,规定了异种胰岛的质量规范以及伦理等方面的要求,标志着临床异种胰岛移植技术的成熟。肾脏移植的临床前试验也取得了很大的进步。2021年王毅教授带领的团队 [21]将 GTKO/hCD55和 GTKO/B4GalNT2KO/hCD55/ hTBM猪肾脏移植给猕猴,证实 B4GalNT2基因的敲除能有效降低猕猴血清中异种抗体的结合,明确 Sda抗原在猪到猴异种肾移植中的重要作用,开展了使用免疫抑制剂的猪肾脏移植,受体猴存活 32 d,达到国际领先水平。

四川省人民医院邓绍平教授和潘登科教授团队先后培育出的 10种基因编辑猪[22],包括 GGTA1、 CMAH和 βGalNT2 的 3基因敲除和 hCD46、 hCD55、hTBM、hEPCR、hEPO、hLEA29Y和 hCD47转基因猪,提供给全国各大中心,合作开展胰岛移植和肾脏移植前试验[21, 23]。

我国的异种器官移植临床前试验积累了一定经验,本次马里兰医学中心异种心脏移植案例的临床研究探索,为我国开展异种器官移植临床研究提供了宝贵的经验。 

4  其他问题

尽管目前已经将基因编辑猪肾脏及心脏移植到人体中,但异种移植仍然面临着复杂的免疫排斥问题和生物安全问题[15]。

目前已有各种类型的基因修饰猪,其中大多数正在开展临床前猪到非人灵长类动物(non-human-primate,NHP)异种移植模型中进行测试。新的异种反应性抗原可能被发现,基因编辑技术可以让我们在短时间内生产出新型基因工程猪。笔者认为,基于 NHP模型研究的数据,将不同的转基因猪与不同的免疫抑制疗法结合起来,对于不同器官的有效移植是必要的。因此,在猪 -NHP模型中确定最佳的基因工程猪和免疫抑制方案是临床研究的前提。

生物安全问题是指跨物种感染的风险,比如细菌感染、外源性病毒感染、内源性逆转录病毒感染等。未经净化的猪可能会携带感染人类的病原体,包括布鲁氏菌、结核分支杆菌等,也包括流感病毒、猪淋巴细胞疱疹病毒、猪内源性逆转录病毒等。针对移植器官的细菌感染和外源性病毒感染风险,可以通过屏障环境结合剖腹产手术培育无特定病原体(specific pathogen free,SPF)猪。有关猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV),一般认为 PERV整合在猪基因组内,存在多个拷贝,在不同品种及个体中拷贝数差异很大,分 PERV-A、B、C 3个亚型,多数为缺陷型,仅少数是完整的。临床研究共识要求供体猪无 PERV-C亚型即可。2017年杨璐菡团队[24]利用 Crispr/cas9技术实现 PERV相关基因的敲除,去除了猪内源性病毒感染风险。然而,PERV敲除的必要性以及对人的感染性仍需进一步研究。在报道的几例猪到人的肾脏、心脏移植临床研究中,供体猪均未进行 PERV敲除,术后监测结果中也未发现 PERV感染的证据。 

5  结果与展望

随着异种移植临床研究的开展,安全性和伦理考虑已成为讨论的重点,需要严格的伦理法规。关于临床异种移植的监管挑战和伦理问题正在全球范围内被提出。早在 2003年,美国食品和药物管理局首次发布了异种移植指南[25],2016年更新了异种移植的指导方针和法规,以更好地规范和安全进行异种移植的临床试验。

全球第 1例猪心脏到人体的移植成功,为以后心脏移植到人体的长期存活提供了借鉴,也为将来其他器官移植到人体提供了经验与技术。相信很快会有更多的异种移植临床研究在国内外开展,来共同推进异种器官移植从实验阶段到临床应用。

重要声明和参考文献略。

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关键词:
移植,临床,实验,基因,器官

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