DNA异常甲基化在肺癌诊疗中的应用价值 | 实验室诊断技术导航

据全球最新癌症数据显示：肺癌已成为癌症死亡的首因，发病率居世界第二，多数肺癌患者确诊后5年生存率仅为10% - 20%[1]。

因肺癌早期无典型的临床表现，确诊时多为进展期，因此肺癌诊断的研究重点是寻找较为敏感及特异的标志物以辅助肺癌早期诊断。而CpG岛局部高甲基化及基因组DNA整体低甲基化在肺癌的发生发展起着至关重要的作用。

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临床诊断优势

多轮低剂量螺旋CT筛查可显著降低有吸烟史的高风险人群肺癌死亡率 [14, 15] ，但对肺部结节鉴别诊断的特异性差，且多次辐射暴露会加重患者心理负担。 肺组织病理活检作为肺癌诊断的金标准，存在以下不足： 01 肿瘤存在异质性，部分组织样本不能完全代表疾病状态； 02 对早期肿瘤、残留病灶以及早期复发的检测较为困难； 03 侵入性有创操作，易引发相应并发症。 ★ 而DNA异常甲基化在肺癌的不典型增生期即可出现 [16] ，并在癌症进展过程中持续存在 [17] ，可通过检测痰液或者外周血中循环肿瘤DNA异常甲基化辅助肺癌诊断。虽然对痰液进行DNA异常甲基化检测诊断敏感性更高 [18] ，但早期肺癌患者可能无明显的临床表现，导致无痰液咳出，故而对外周血中循环肿瘤DNA异常甲基化的检测应用更广泛。

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DNA高甲基化与肺癌

Kneip等人报道了单独用血浆中SHOX2高甲基化诊断肺癌时,敏感性为60%，特异性可达到90% [19] 。肿瘤干细胞由肿瘤细胞去分化发展而来，具有强大的自我更新、多重分化、增强转移的能力，虽然占肿瘤总数的不到1%，但它们是导致放疗或常规化疗耐药性和侵袭性进展的主要因素。 RASSF1A基因启动子区甲基化的肺癌细胞可触发肿瘤细胞向癌症干细胞转化并可促进肿瘤细胞体内转移性播散 [20] 。 在肺癌患者中对血浆中SHOX2、RASSF1A高甲基化联合检测可将诊断敏感性提高到96.67%，而特异度并无明显下降 [21] ，上述结果表明SHOX2、RASSF1A高甲基化作为辅助肺癌诊断的生物学标志物有良好的应用价值。 2017年国家药品监督管理局批准了SHOX2、RASSF1A甲基化DNA检测试剂盒，用于体外定性检测人肺泡灌洗液中这两个基因的甲基化情况。另外，SHOX2联合PTGER4基因甲基化在I、II期肺癌的诊断灵敏度可分别达82.5% 和 90.5% [22] 。 组蛋白基因HIST1H的多个CpG位点在肺癌患者均呈现高甲基化，尤其是应用HIST1H4F 和HIST1H4I两个位点的甲基化联合检测肺癌，诊断灵敏度可达92.9%，诊断特性度可达96.0%，尤其在I期肺癌检测方面效果显著 [17] 。 Alicia Hulbert团队筛选出三个肺癌特异性甲基化基因（TAC1, HOXA17和 SOX17），三者联合检测显著提高肺癌诊断性能 [18] 。因此，多个基因高甲基化联合检测可显著提高肺癌诊断的检出率。 

组蛋白基因不同位点的高甲基化将有助于肺癌不同类型的诊断 [17] 。 

• 肺腺癌： HIST1H2AG, HIST3H2A, HIST3H2BB, HIST1H3发生高甲基化

  • 肺鳞癌： HIST1H4A, HIST1H3A, HIST1H2AL, HIST1H3I高甲基化 

•  小细胞肺癌： HIST1H2BL, HIST2H3D, HIST1H2AJ, H2AFJ, HIST1H2AI, HIST1H1D被特异性甲基化 因此 且肺癌病灶体积越大，TNM分期越高，肺癌特异性基因甲基化水平则越高，肺癌患者行手术治疗后，肺癌特异性基因甲基化水平较术前将显著下降 [23] 。 TMEM196基因作为抑癌基因，启动子区发生高甲基化后，其表达水平下降。与未甲基化的肺癌患者相比，TMEM196高甲基化的肺癌患者总体生存率更低 [24] 。

抑癌基因启动子区高甲基化还与靶向药物的耐药相关，吉非替尼可用于EGFR基因突变阳性的非小细胞肺癌患者，研究发现WIF1基因启动子区甲基化程度越高，非小细胞肺癌患者对吉非替尼的反应越差，患者的无进展生存率及总体生存率也显著降低 [25] 。因此，肺癌特异性基因高甲基化在肺癌诊断、预后评估以及靶向药物疗效监测等方面均具有良好的应用价值。

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DNA低甲基化与肺癌

DNA甲基化的缺失是首个在癌症中被发现的表观遗传学改变。全基因组低甲基化可发生在DNA重复序列、癌症相关基因的转录调控区域等位置 [13] 。多项吸烟相关的甲基化差异表达研究发现F2RL3呈现低甲基化状态 [26, 27] ，尤其是在65岁及以上的吸烟人群中F2RL3基因低甲基化与肺癌的发生率及死亡率显著相关 [28] 。 正常情况下SPANXC基因仅在睾丸组织中表达，而SPANXC基因启动子区低甲基化时可使其在肺腺癌组织中被激活，促进肺腺癌细胞的转移 [29] 。 DNA低甲基化也可影响下游抑癌基因启动子区使其发生高甲基化，抑制抑癌基因转录 [13] 。对应用免疫检查点(PD-1)抑制剂治疗的非小细胞肺癌患者进行DNA顺势调控元件 （包括增强子和启动子） 测序，比较抗PD-1治疗有反应和无反应的患者发现DNA甲基化存在差异表达，尤其是低甲基化的CYTIP和TNFSF8基因对抗PD-L1疗效有良好的预测性，甲基化水平越低，疗效越差，无进展生存率和总体生存率越低 [30] 。 在肺鳞癌中，DNA重复序列LINE-1低甲基化被证实是癌症特异性改变，与基因组不稳定性相关 [31] 。逆转录转座是通过逆转录将转座子特异插入基因组而发生染色体重排的一种机制。LINE-1序列低甲基化可促进逆转录转座过程，导致LINE-1与FGGY基因重排形成LINE-1-FGGY，干扰FGGY抑癌基因的表达以及介导癌症细胞的局部免疫逃逸 [32] 。肺鳞癌的基因突变频率低于肺腺癌导致靶向药物治疗效果不明显，通过应用免疫检查点抑制剂治疗可提高肺鳞癌患者的无进展生存率和总体生存率 [31] ，而LINE-1低甲基化介导肿瘤局部免疫逃逸会降低免疫检查点抑制剂的疗效。因此，DNA低甲基化不仅促进肺癌的发生发展，也会降低肺癌免疫检查点治疗的疗效。

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DNA甲基化与其他肿瘤

DNA异常甲基化在肺癌中具有良好的应用价值，在其他肿瘤中也被广泛应用。不同亚型乳腺癌的基因突变可能仅存在部分患者中，但循环肿瘤DNA异常甲基化可普遍存在于各种亚型的乳腺癌患者。血液中Septin9甲基化检测首先被美国食品药品监督管理局批准用于结直肠癌的筛查。在中国人群中对结直肠癌患者进行术前Septin9甲基化检测，结果提示Septin9甲基化诊断敏感性显著高于癌胚抗原 （CEA） ，并随肿瘤分期增加而升高，尤其是在区分局部与转移性结直肠癌方面具有良好的能力 [38] 。

◤ 随着高通量测序的发展，越来越多的组织DNA异常甲基化被发现，在血液、痰液、肺泡灌洗液、尿液等体液中检测肺癌特异性DNA异常甲基化改变的证据也在逐渐积累，未来努力的方向在于通过大量的临床样本验证特异性的DNA异常甲基化的临床实用性以及实施更多的临床试验验证DNMTs抑制剂联合传统肺癌治疗方案的临床有效性。DNA异常甲基化助力肺癌精准医疗指日可待。

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编辑 | 骆秉涵 王迪

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