以纳米孔测序为代表的第三代测序，你了解吗？| 专家论坛

20世纪以来，随着分子生物学的飞速发展，基因测序等分子诊断技术已逐渐成为检验医学领域和公共卫生的重要检测手段。一代测序即Sanger测序打开了DNA测序的大门，很快成为许多疾病分子诊断的“金标准”，但它昂贵的测序成本和较慢的测序速度限制了其在多样本大规模测序项目上的使用。二代测序的测序通量高且测序成本较低，但文库构建复杂繁琐、测序读长短、序列分析时间长且仪器相对昂贵。近年来，以纳米孔测序为代表的第三代测序技术飞速发展，有望突破第一、二代测序技术的瓶颈，是测序技术史上的又一次飞跃式发展。

 （ 作者：李一荣 李雪寒 付宇 ）

01 纳米孔测序新技术的发展 

纳米孔测序技术的开发起源于20世纪80年代，最初使用的纳米孔材料为生物纳米孔—由某种天然存在的蛋白质分子镶嵌在磷脂双分子层上而组成的纳米孔材料，如金黄色葡萄球菌α溶血素、耻垢分枝杆菌孔蛋白 A及噬菌体phi29连接器马达蛋白等。 

到20世纪90年代，研究人员通过对生物纳米孔的探索和优化，提高了纳米孔测序的精度。但生物纳米孔因其固有的局限性，如膜的稳定性差、电流噪声较大、不能保持孔径大小均一性等，影响了单分子核苷酸的测序质量。 

21世纪初，以硅及硅的衍生物为主要材料的固态纳米孔应运而生，固态纳米孔比生物纳米孔具有更高的稳定性和耐用性。 

2014年英国牛津纳米孔技术公司 （Oxford Nanopore Technologies，ONT） 推出了全球第一台商业化固态纳米孔测序仪MinION，从此纳米孔测序技术逐渐走向成熟。   

02 纳米孔测序技术的特点 

① 较长的测序读长： 纳米孔测序技术利用碱基穿过纳米孔时电信号的改变实现测序，原则上可检测通过纳米孔的全部核酸序列，因此对测序长度没有限制，目前最长读长可达2.4M。 ② 可实时测序： 测序文库制备过程简单， 无需对样品中核酸进行PCR 扩增或逆转录 ，可以直接对DNA或RNA进行测序，节约了操作时间同时降低了测序成本。可边测序边输出结果，能够实现对测序数据的实时分析。 

③ 纳米孔测序设备简单便携： 目前使用最成熟的MinION测序仪可在极地、海洋甚至太空等各种复杂环境下完成实时测序，可保证对突发疫情处理的时效性。虽然原始数据对单核苷酸的检测准确率有待提高，但组装后经校正，碱基的准确度可达99.8％以上。 

④ 可直接对RNA进行测序： 纳米孔测序可以直接对各类形式的RNA进行测序，能避免目前对RNA病毒进行测序和研究时必须将RNA逆转录为DNA扩增所产生的偏向性及可能引入的突变，这一特点在RNA病毒检测领域具有巨大的吸引力。   

03 纳米孔测序技术在病原体检测中的应用 

纳米孔测序技术已应用于许多感染性疾病病原体的识别。利用纳米孔测序技术诊断感染性病原体的方法主要有基于细菌16S核糖体RNA （16S ribosomal RNA，16SrRNA） 和真菌内源转录间隔区 （internally transcribed spacer，ITS） 的靶向测序以及基于所有基因进行建库的宏基因组测序。   

靶向测序: 目前，基于细菌16SrRNA和真菌ITS的靶向测序已成功识别了样本中的细菌和真菌，使用MinION测序仪9.5版测序芯片可实现99%的测序准确性。 

刘晔等通过纳米孔16SrRNA靶向测序从患者支气管肺泡灌洗液标本中检出包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等在内的16种病原体， 远高于常规培养法检出的病原体数量 。 

在临床微生物检验中，病原体的耐药性检测与病原 体的分离鉴定同样重要，而纳米孔靶向测序在病原体耐药性检测中也有广泛的应用。 

Gong等对肝脓肿样本进行纳米孔靶向测序，在4小时内识别出样本中的肺炎克雷伯菌的2个亚型，并发现了emrB、macB等7个耐药基因。 与普通的培养法相比，极大缩短了鉴定时间，为临床快速病原诊断与早期抗生素治疗提供了重要依据。   

宏基因组测序: 纳米孔宏基因组测序可直接从患者样本中检测全部核酸，与其他测序技术相比， 其在检出未知病原时可获得较多基因组信息，对基因组中存在重复序列和复杂结构的病毒研究具有独特的优势。 

Cheng 等人对7例感染性心内膜炎患者的心脏瓣膜组织进行纳米孔宏基因组测序，结果显示所有样品中均能检出链球菌，而传统的微生物培养法则为阴性。 

有研究报道，研究人员使用MinION测序仪检测大肠杆菌的耐药元件，宏基因组测序数据的长读长能确定可移动耐药元件的存在，并能发现位于同一耐药元件上的不同耐药基因的组合。这有助于更好地阐述多重耐药大肠杆菌中位于同一耐药元件上的不同耐药基因的传播规律。   

04 纳米孔测序技术在传染病防控中的应用 

鉴于纳米孔测序设备操作简单，携带方便的特性，对资源的需求相对较少，可在疫区现场对样本进行实时检测，非常适用于流行病的现场测序和基因分析。 

▶  在埃博拉疫情期间，科研人员利用纳米孔测序技术现场对埃博拉病毒进行基因组测序，实现了对疫情的实时监测，并通过系统进化分析，揭示病毒进化来源，为疫情溯源及防控提供了重要的科学依据。 

▶ 在2020年的COVID-19疫情中，研究人员通过宏基因组测序、多重PCR以及纳米孔测序完成了广东省53株SARS-CoV-2的全基因组序列测序，根据序列分析结果和流行病学信息，发现广东省该轮COVID-19疫情为输入性传播，而非本地传播。这对随后广东省实施的针对输入性传播的防控措施具有指导意义，对疫情发展不同阶段所需采取的干预措施，以及对其它地区开展SARS-CoV-2测序分析并科学解释测序结果具有较大的参考价值。   

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编辑 | 骆秉涵 王迪

原文以《纳米孔测序新技术临床诊疗价值与发展前景》为题发表在《临床实验室》杂志2022年5月刊专题“分子诊断”专家论坛版块

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