综述 CAR-NK 细胞的设计

来源 | 小药说药

人类自然杀伤（NK）细胞占所有循环淋巴细胞的15%。NK 细胞表现出抗肿瘤细胞毒性，无需事先致敏以及细胞因子和趋化因子的作用。由于 NK 细胞能够识别和杀死肿瘤细胞，以 NK 细胞为基础的肿瘤免疫治疗领域越来越受到人们的重视。

嵌合抗原受体 （CAR） 是一种受体蛋白，它赋予免疫细胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。CAR-T 细胞治疗在血液恶性肿瘤取得了巨大的成就。然而 CAR-T 细胞仍存在一些不足，例如在实体瘤的治疗中显示出很低的疗效；此外，大多数的 CAR-T 细胞免疫疗法需要自体过继细胞移植，因为除非处理HLA屏障，否则异基因T细胞可能导致移植物抗宿主病 （GvHD） ；另外，CAR-T 细胞免疫治疗可能会产生一些副作用，如细胞因子释放综合征。

最新的研究表明，CAR-NK 细胞可能会克服 CAR-T 细胞的上述缺陷，并显示出显著的抗肿瘤作用。CAR-NK 细胞在肿瘤的免疫治疗中展现出广阔的前景。

CAR-NK的研究概况

CAR-NK 临床前研究的数量逐年增加，这体现在每年都在增加的关于 CAR-NK 的研究论文。

此外，在研究的靶标方面，HER2 是实体瘤最常用的靶点，而 CD19 抗原在血液肿瘤中最常见。使用原代 NK 细胞的研究中，65%的人在研究B细胞恶性肿瘤，CD19 是最受欢迎的靶点。有趣的是，在使用 NK 细胞系的研究中，研究实体瘤是血液恶性肿瘤的2倍以上。

在临床研究方面， CD19-CAR-NK 细胞对血液系统肿瘤有很高的应答率。除了 CD19 外，淋巴瘤和白血病的 CAR-NK 细胞临床研究也针对 CD7（ NCT02742727 ）和 CD33（ NCT02944162 ）。目前，有几种针对血液恶性肿瘤的 CAR-NK 细胞临床试验正在进行中。

还有多项针对实体瘤的研究处于启动或招募阶段。

CAR结构的设计

NK 细胞上表达的功能性 CAR 分子由三部分组成：胞外结构域、跨膜区以及胞内的信号结构域。胞外结构域由一个信号肽和识别抗原的单链抗体片段 （scFv） 组成，一段铰链区将这个结构连接到跨膜区，它也在细胞内连接到包含激活信号的胞内结构域。成功的 CAR 设计是通过仔细的设计和功能测试相结合来实现的。

载体骨架和启动子

载体骨架包含表达 CAR 所需的所有元件，如启动子、polyA 信号和转录调控片段。

启动子的选择直接影响到转基因的表达水平。目前，对不同启动子在 NK 细胞系中的 CAR 表达和功能的比较只有一次报道，而对原代 NK 细胞没有比较数据。就这一次单个报告来看，还不能确定 CAR-NK 细胞的最佳启动子。

目前关于 CAR-NK 细胞的报道显示，多种启动子被用于驱动 CAR 的表达，无论是细胞系来源的还是原代 NK 细胞。在原代 CAR-NK 和 CAR-NK 细胞系中，病毒启动子 （CMV、MPSV、MMLV、SFFV等） 比组成性活性启动子 （如EF1α、CMV和PGK） 更常用。

信号肽

在信号肽中存在着巨大的异质性，这直接转化为不同水平的蛋白质分泌效率。对于 CAR-NK 和 CAR-T 细胞，还没有确定最佳信号肽的比较研究。目前，CD8a-SP 是原代 NK 细胞最常用的信号肽序列 （16%，71%的研究中未公布） 和 NK 细胞系的免疫球蛋白重链或轻链信号肽 （29%） 。

单链抗体

单链抗体片段是 CAR 的肿瘤抗原结合域，该结构域将决定 CAR-NK 细胞的特异性和功能。

由于单链抗体不是抗体的天然形式，因此重链和轻链的顺序是人工确定的。到目前为止，对于 CAR-NK 设计，大多数更喜欢 VH-VL 方向，而不是 VL-VH 方向。Fujiwara 等人证明重链和轻链的顺序不影响T细胞上抗 KDR CAR 的表达水平。

此外，细胞可以配备多个单链抗体，从而扩大 CAR 效应细胞的抗原识别能力。在这里，有多种选择：CAR 可以用双元件的载体转导，诱导两个 CAR 结构的表达；或者将两个单链抗体融合在一个结构中，产生串联单链抗体的“单柄” CAR。虽然这些技术已用于生产 CAR-T 细胞，但 CAR-NK 细胞仍未知。

目前大多数临床 CAR-T 细胞试验都使用了来自小鼠抗体的单链抗体，这增加了抗小鼠 IgG 细胞宿主抗移植物病的风险，这个问题可以通过人源化或筛选全人抗体避免。然而不幸的是，由于这些 CAR 受体的嵌合特性，即使是人源化的单链抗体也可能诱导宿主抗独特型免疫反应。幸运的是，在迄今为止数量有限的 CAR-NK 临床试验中，没有发现与抗 CAR 免疫反应相关的重大副作用。

连接区

重链和轻链之间的连接区有助于稳定单链抗体的构象，过短会导致多聚体的形成，过长可能导致水解或降低 VH 和 VL 结构域之间的关联。对于 CAR-NK 细胞，五肽 GGGGS 的多聚体应用最为广泛，通常为3个重复。另一个旨在增强蛋白水解稳定性的连接体是 Whitlow“218” 连接体：GSTGSGSKPGSGEGSTKG。

目前，虽然大多数 CAR-NK 研究没有提供连接细节，但已有的研究报道中，有22项使用了 G4S 连接，有2项应用了218连接。

铰链区

铰链区是连接单链抗体单位和跨膜结构域的 CAR 细胞外结构区，它通常维持效应细胞中稳健的 CAR 表达和活性所需的稳定性。大多数 CAR-NK 构建使用 CD8α 或 CD28 胞外结构域的衍生物或基于 IgG 的铰链区。

铰链区的类型和长度对 CAR 的功能活动有重要影响。但是目前大多数信息全来自 CAR-T 领域，能否直接转化为 CAR-NK 还有待证明。

在 CD28 和 CD8α 铰链区之间的直接比较中，发现 CD28 更有可能促进 CAR 分子的二聚化，因此，CD28 铰链区的 CAR 产生的激活刺激更强。虽然这可能是有益的，但也可能导致更严重的副作用。

IgG 为基础的铰链区也广泛应用于 CAR 结构。基于 IgG 铰链区的一个主要优点是结构的灵活性，该结构通常由 IgG1 或 IgG4 的 Fc 部分或 Fc 部分的 CH2/CH3 结构域组成。铰链区的长度可以调节以适应抗原识别，但研究发现，间隔区越短，细胞因子的产生越高，CAR-T 细胞增殖越快，体内持久性和抗肿瘤效果越好。

对于 CAR-NK 细胞，大多数研究在原代 NK 细胞 （16/35） 和 CAR-NK 细胞系 （41/72 ）中均采用 CD8α 铰链区。其它使用的铰链区包括 CD28、IgG Fc 结构域和 DAP12。

跨膜结构域  

跨膜结构域连接CAR的胞外结构域和细胞内激活信号结构域，CAR-NK 最常用的跨膜部分来自 CD3ζ、CD8 和 CD28，但其他如 NKG2D、2B4、DNAM1 也有被使用。

跨膜结构域的选择影响了 CAR 结构在细胞功能上的活化程度。通常在 NK 细胞上表达的分子如 DNAM-1、2B4 和 NKG2D 的跨膜会导致更多的 CD107a 脱颗粒和更高的细胞毒性，因此，跨膜的具体来源将决定 CAR-NK 的活性。

跨膜结构域的一个重要方面是，最佳跨膜区域应遵循T细胞或 NK 细胞上跨膜蛋白的蛋白质自然取向 （N端到C端顺序） 。NKG2D 虽然是一种强大的 NK 细胞激活剂，然而，天然 NKG2D 具有 C 端到 N 端的跨膜区。

目前，CD8α 和 CD28 修饰的跨膜在原代 CAR-NK 细胞中最常见，而 CD28 是 CAR-NK 细胞系的首选跨膜区域。

CAR-NK激活信号

CAR 的细胞内激活信号的数量决定了其属于哪一“代” CAR。

第一代 CAR-NK 细胞与 CAR-T 细胞一样，只含有 CD3ζ 信号。第二代和第三代 CAR-NK 分别携带一个和两个额外的共刺激信号，共刺激分子通常来源于 CD28 家族 （CD28和ICOS） 、TNFR 家族 （4-1BB、OX40和CD27） 或 SLAM 相关受体家族 （2B4） 。到目前为止，唯一公布的 CAR-NK 临床试验采用了第二代 CAR-NK 构建，该构建通过加入 IL-15 表达和诱导 Caspase9 增强活性。

目前大多数 CAR 结构依赖于 CD3ζ 链信号域，强烈的激活信号对于诱导有效的抗肿瘤反应很重要，但也可能导致效应细胞的快速衰竭。因此，共刺激域的组合可用于校准所需的免疫细胞反应。与基于 4-1BB 的 CAR 相比，基于 CD28 的 CAR 表现出更快的效应器特征，诱导更高水平的 IFN-γ、颗粒酶B、TNF-α。然而，这种强烈的共刺激信号也会导致活化诱导的细胞死亡 （AICD） 。

相比较，4-1BB-CD3ζ 信号优先诱导记忆相关基因和持续的抗肿瘤活性。原因可能是 4-1BB 结构域改善了 CD28 结构域引起的T细胞耗竭。

如上图所示，在 CAR-NK 细胞系和原代 CAR-NK 细胞的研究中，CD3ζ 几乎被普遍用作主要的激活域，其中大约一半携带一个额外的激活域，通常添加 4-1BB 或 CD28。至于第三代结构，CD28/4-1BB/CD3ζ 的组合是最常用的。

CAR的转染或转导载体

随着基因修饰技术的进步，许多方法被用于产生 CAR-NK。两种主要方法是病毒转导（ 使用慢病毒或逆转录病毒 ），或转染裸质粒 DNA、转座酶 DNA 介导的整合以及 mRNA 电转。

慢病毒

慢病毒能够高效地转导周期性和非周期性细胞，在基因治疗领域得到了广泛的应用。迄今为止，已有14篇关于原代 CAR-NK 细胞和44篇关于 CAR-NK 细胞系的研究成功使用慢病毒作为载体。

在临床前研究中，21项研究使用了第二代病毒，6项研究使用了第三代慢病毒来产生表达 CAR 的 NK 细胞系 （17个未知） 。在原代 CAR-NK 细胞研究中，5项研究使用了第三代慢病毒，7项研究使用了第二代慢病毒载体 （2个未知） 。

逆转录病毒

几十年来，逆转录病毒一直被用作基因治疗载体。迄今为止，有20项使用 CAR-NK 细胞系的研究和15使用原代 NK 细胞的研究应用了逆转录病毒。最近的一项I期临床试验中，由逆转录病毒转导的 CD19 CAR-NK 细胞治疗 CD19+ 非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。在这项研究中，73%的患者有响应，8名患者中有7名获得完全缓解。此外，在所有剂量水平下，CAR-NK 输注后30天内反应迅速。经过一年的随访，仍然可以检测到扩增的 CAR-NK 细胞。输注后，外周血中的 CAR-NK DNA 拷贝数保持稳定达一年之久，这些结果首次表明逆转录病毒转导的 CAR-NK 细胞可以在体内长期存活。

不同种类的逆转录病毒被用来产生 CAR-NK 细胞。与γ逆转录病毒和慢病毒相比， RD114α 逆转录病毒在原代 NK 细胞的转导效率上更高。尽管使用不同的逆转录病毒可以在 NK 细胞中获得长时间稳定的 CAR 表达，但逆转录病毒系统的安全性仍然是一个值得关注的问题，尤其是与更安全的慢病毒相比。

mRNA电穿孔

电穿孔 CAR 编码 mRNA 是一种快速、有效但是作用短暂的一种方法。迄今为止，有9个关于 CAR-NK 细胞系和11个原代 CAR-NK 细胞研究使用了 mRNA 电穿孔。

一般来说，扩增或活化的 NK 细胞的 mRNA 转染效率远高于新鲜分离的 NK 细胞。由于 mRNA 的合成符合 GMP 的规定，并且电穿孔可以在洁净室中进行，因此通过 mRNA 电穿孔产生符合 GMP 的 CAR-NK 是可行的。然而，这种方法的主要缺点是 CAR 表达的窗口短暂：电穿孔后，CAR-NK 细胞应在7天内输回患者体内。

睡美人转座子

基于转座子的系统可以在预定的位置高效地导入 CAR 转基因，这是传统方法所不具备的一个重要优势。转座子主要通过电穿孔导入 NK 细胞，然后通过转座子酶整合到宿主基因组中。有两项研究应用转座子系统来产生 CAR-NK 细胞：一项使用 NK-92-MI 细胞，另一项研究将转座子转染到 iPSC 细胞，然后分化成 NK 细胞。富集后，抗间皮素 CAR 在 iPSC 来源的 NK 细胞上稳定表达，并在卵巢癌小鼠模型中发挥出作用。

CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 是一种强大的基因改造技术，这项技术依赖于将 Cas9 蛋白与 gRNA 一起导入 NK 细胞。最初，这种技术被用于原代 NK 细胞，以破坏 CD38 基因，旨在防止 NK 细胞与daratumumab （抗CD38） 联合使用时的自相残杀，因为 CD38 在 NK 细胞、多发性骨髓瘤和 AML 细胞上均有表达。

最近，CRISPR/Cas9被用于引入新基因。在一些采用 HDR 模板的研究中，使用 K562-mIL-21 扩增的 NK 细胞获得了超过75%的敲入效率。然而，在新鲜 NK 细胞中，敲入效率仅为3–16%。总的来说，CRISPR/Cas9 策略是一种很有前景的技术，它可以用来精确地删除、修复或导入特定基因，有望产生强大的抗肿瘤 NK 细胞。

小结

NK 细胞是一类独特的抗肿瘤效应细胞，具有不受 MHC 限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能。CAR-NK 细胞疗法是一个很有前途的临床研究领域，对某些癌症患者具有良好的安全性和初步疗效。

目前，对 CAR-NK 细胞的研究越来越多，基于 CAR-T 细胞治疗的成功经验，以及新技术和新方法的应用，相信 CAR-NK 细胞治疗一定能够克服种种挑战，为肿瘤治疗带来新的突破。

参考文献 ：

1. Chimeric antigen receptornatural killer (CAR-NK) cell design and engineering for cancer therapy. JHematol Oncol. 2021; 14: 73.

2. Natural Born Killers: NK Cells in Cancer Therapy. Cancers (Basel). 2020 Jul 31;12(8):2131