子宫内膜癌的前瞻性分子分型：机构应用、实践和临床经验

论文重点内容

摘要

癌症基因组图谱（TCGA）对子宫内膜癌（EC）进行了全面的基因组分析，发现了四个不同的、具有预后意义的分子亚群。分子分型与临床病理特征相结合，可能可以改善风险分层。分子分型最近已被纳入国家和国际患者管理EC指南。因此，在未来几年，分子分型在常规病理和临床实践中的应用可能会显著增加。建立一个高效和标准化的工作流程，对EC进行分子分型，并以综合方式报告分子和组织学发现，这是势在必行的。本文我们描述了我们如何对所有在我们机构诊断过的EC，实施快速和常规分子分型。为此，我们使用免疫组化作为替代标记物，以识别DNA的错配修复（例如，MLH1, PMS2, MSH6, MSH2），TP53基因的遗传和/或表观遗传改变。此外，我们还开发和使用了一种单基因的POLE SNaPshot检测方法，这是一种快速、灵敏的方法，用于检测选择性的POLE核酸外切酶区的基因突变(EDMs)。我们报告了我们的分子检测工作流程和综合报告系统，以及310例EC在我们机构进行常规分子分型的临床病理和分子特征。310例EC的分子分型如下：15个（5%）POLE突变（POLEmut）， 79个（25%）错配修复缺陷（MMRd）， 135个（44%）无特异性分子表达谱（NSMP）， 81个（26%）p53异常（p53abnl）。这项工作为实施EC常规分子分型提供了一个初步的框架。 

结果

实施常规和综合的分子分型

在这里，我们展示了切片级评估模型(图1A-C)。首先，我们使用包含肿瘤和非肿瘤组织以及不含任何肿瘤组织的正常组织（非肿瘤结直肠组织）的切片图像，采用三次交叉验证的方法，评估了切片级评估模型切片级自动检测肿瘤的能力。在DACHS (n = 2,448例患者)中，这达到了0.980的高水平ROC曲线(0.975, 0.984)。这表明，在切片级标注上训练的神经网络可以很好地区分切片和非切片。接下来，我们从两类转移到三类，探讨了切片级评估模型在肿瘤分级中的准确性。根据当地标准测量，每张切片的等级按真实标注主要分化为低级别（1-2级）和高级别（3-4级）。将目前最好的模型应用于分级目标，ROC曲线为0.722 （0.699，0.744;补充资料见图S3A），通过切片级评估模型将其ROC曲线提高到0.751 （0.727，0.774；参见补充材料）。作为阴性对照，即不应检测到的目标特征，我们想要推断出性别。而事实上，基线模型和切片级评估模型都不能从原始组织病理学切片中可靠地推断出性别，ROC曲线接近0.50。

在我们机构开始对所有EC进行分子分型之前，我们制定了病理工作流程，以确保病例检测和综合报告的效率和标准化。所有EC病例首先进行传统的组织学评估。随后，选择表现出最高的肿瘤细胞性的最优的FFPE组织块进行辅助研究，包括p53和MMR蛋白（PMS1，PMS2、MSH2和MSH6）IHC，作为这些基因标记变化的代替标志物，以及使用SNaPshot试验方法析POLE热点突变。分子实验室每周例行进行POLE基因突变分析，结果直接显示在电子病历中。

基于先前的验证研究，保守地认为，POLE试验能够可靠地检测到20%肿瘤细胞的POLE变异，这相当于单个等位基因突变的VAF（变异等位基因频率）约为10%。值得注意的是，由于肿瘤细胞密度的估计存在一定的主观性，在10% VAF以下仍可能检测到一些变异，因此肿瘤细胞密度约为5-20%的肿瘤仍需进行分子检测。然而，当肿瘤细胞密度估计低于20%时，该报告会包括一个免责声明，警告假阴结果的风险。如果临床需要的话，会建议换一种更为灵敏的分子检测方法（例如，下一代测序）。病理报告中总结了免疫组化和POLE结果，以及最终的分子分型亚组。

大多数EC病例中（95%）形态明确，并根据组织学的发现来发布诊断报告，以加快临床分诊和管理。完成POLE检测后，发布初始病例报告的附录，提供免疫组化和POLE分子检测的结果，并分配分子分型亚组。值得注意的是，在选定的病例中，当诊断需要或有要求时，初步报告中会报告全部或部分免疫组化；然而，这些结果随后在附录中会被重新总结为最终分子状态（图1A）。 

图1

分子分型测试方案及综合报告流程。A大多数病例的组织型是明确的，诊断报告在第1周发布，随后的IHC和POLE分子检测结果在第2周的分子分型附录中报告。如果诊断需要或有要求，可以在初级报告中报告免疫组化结果，并在附录中对最终的分子分型进行重新总结。在少数病例中，形态学是不明确的和/或存在可疑的潜在POLE突变；因此，诊断报告是在分子分型测试完成后在第2周发布的。 

另外，少数病例（5%）表现为高级别和/或不明确的形态模式，诊断具有挑战性，并有广泛的差别（如浆液性癌或透明细胞癌），可通过辅助免疫组化和/或POLE分子检测进一步细化。在这种情况下，病例会一直保留到免疫组化和POLE测试完成之后，然后发布一份考虑到形态学发现和分子背景的诊断报告（图1B）。鉴于已知高级别EC的子集仅通过形态学评估就存在较差的观察者间一致性，该工作流旨在提高诊断的重现性。

每个病例的分子分型使用标准化的文本和格式集中总结到病理报告中，以达到高效报告和读者解释的目的。附录报告包括四部分：(1)描述性标题，引用TCGA研究确定的分子定义亚群; (2)描述性、解释性评论；(3)每项检测的单个结果；(4)最终的分子分型标记（例如，POLEmut、MMRd、NSMP或p53abnl）。手术病理报告中的POLE分子检测结果的评论来源于最终的分子报告，参考该报告以获得对检测结果更详细的描述。  

值得注意的是，少数肿瘤可能表现出一种以上的分子特征，被称为“多重分型”EC。例如，EC可能显示MMRd和p53abnl (MMRd-p53abnl)，POLEmut和p53abnl (POLEmut-p53abnl)，或POLEmut和MMRd (POLEmut-MMRd)畸变。在“多重分型”的情况下，我们报告了EC的单个最终分子分型亚群，并在解释评论部分记录了二级分型。该报告的结论是基于leo - castillo等人的研究结果表明，MMRd-p53abnl和POLEmut-p53abnl ECs的基因特征、拷贝数改变和临床结果，在层次上分别与MMRd和POLEmut单分型肿瘤聚类，与单分型p53abnl肿瘤有显著差异。

这一现象可能可以解释为，在这些情况下，p53分型是一个次级乘客事件，通常是亚克隆，这也往往反映在p53 IHC模式32。也可以观察到多分型MMRdPOLEmut和POLEmut-MMRd ECs，但根据POLE和MMR蛋白功能的丧失是主要事件还是次要事件，它们显示出不同的遗传结构/特征和临床结果。例如，具有致病性POLE变异的ECs也表现出异常的MMR IHC模式，通常表现出MMR蛋白的亚克隆缺失，在遗传学和生物学上更类似于单一分型的POLEmut ECs。相比之下，继发POLE变异的MMRd肿瘤通常IHC显示MMR蛋白完全缺失，存在非致病性的POLE变异，在遗传学和生物学上类似于单一分型的MMRd ECs。“单分型”POLEmut和“多分型”MMRd-p53abnl EC的附录报告示例如图1所示。 

队列的临床病理特征

在2019年6月至2021年3月期间，共有315例EC内部确诊，或在转诊至我所时在二级病理审查中确诊。在315例EC中，310例有可进行IHC和POLE分子检测的组织。术前子宫内膜活检（51%；159/310）是最常见的检测标本，其次是子宫切除术（46%；142/310）和转移或复发（3%；9/310）标本。310例EC分为4个分子亚组：15个（5%）POLEmut，79个（25%）MMRd，135个（44%）NSMP和81个（26%）p53abnl。1.3%（4/310）的EC病例中发现多个分型，包括2个POLEmut-MMRd和2个MMRd-p53abnl肿瘤。在所有“多重分型”病例中，继发性改变均为IHC亚克隆改变。各分子亚组在年龄、组织类型、分级、分期、淋巴血管侵犯等方面均有显著差异。临床病理特征和分子分型细节分别见表2和图2。

表2

机构队列中EC的临床病理特征 

淋巴血管侵犯，N/A 不适用。 

采用Fisher精确检验，粗体表示有统计学意义（p < 0.05）。

单例EC显示透明细胞和子宫内膜样混合形态，显示亚克隆异常（空核、强、弥漫性核)p53染色模式；然而，免疫组化检测MMR蛋白完整，SNaPshot检测未检测到致病性POLE突变。 

值得注意的是，在310例进行了POLE检测的病例中，有27例（8.7%）的肿瘤细胞性估计为5-15%，这被认为低于该检测的有效分析灵敏度。绝大多数（81.5%；22/27）肿瘤细胞性低的病例是子宫切除术标本，通常以子宫肌层组织为主，而18.5%（5/27）的病例是不足得子宫内膜活检标本。在27例表现为低肿瘤细胞性的患者中，SNaPshot检测未发现POLE变异；因此，根据免疫组化结果，他们被分为NSMP（22/27）、MMRd（2/27）或p53abnl（3/27）亚组。 

图2

常规机构检测中EC的分子分型综述。按分子分型的机构队列图。通过免疫组化评估所有EC的p53和MMR蛋白（MLH1, PMS2, MSH2和MSH6）的异常，并进行热点POLE突变检测。基于分子特征，EC被划分为TCGA研究定义的四个分子亚群之一：POLE突变体（POLEmut）、错配修复缺陷（MMRd）、p53异常体（p53abnl）和无特异性分子谱（NSMP）。MLH1启动子高甲基化研究在显示MLH1/PMS2非亚克隆缺失的EC上进行。有一小部分肿瘤具有更多的分型特征，被称为“多重分型”EC。 

POLEmut组

虽然在我所进行分子分型之前，所有的EC都例行进行了MMR和p53 IHC检查，但这是我们第一次例行检测POLE状态。在这一具前瞻性的研究队列中，共有15例EC携带致病或可能致病的POLE突变（POLEmut）。虽然POLEmut肿瘤占所有EC的5%（15/310），但它们占所有子宫内膜样EC的6.4%（14/220），占高级子宫内膜样EC或不明确的高级别癌的8%（4/49），其他没有特别说明。11例FIGO分级为1-2级，3例FIGO分级为3级，1例具有无法明确组织分型的高级子宫内膜癌特征。POLE SNaPshot检测到以下POLE变体：p. Pro286Arg (c.857C>G; exon 9) (n = 6), p.Val411Leu (c.1231G>C/T; exon 13) (n = 5), p.Ala456Pro (c.1366G>C; exon 14) (n = 2), p. Pro436Arg (c.1307C>G; exon 13) (n = 1) and p.Phe367Ser (c.1100T>C; exon 11) (n = 1)。2例POLEmut病例表现出MSH6亚克隆缺失或MSH6和MSH2同时缺失的“多重分型”特征; 

然而，它们在最终的分型中都被认定为POLEmut。POLEmut的命名是基于两个EC都含有已知的致病性POLE变异（p. Val411Leu和Phe367Ser），并显示IHC导致MMR蛋白亚克隆缺失。这一特征与发生在POLE超突变表型背景下的二级乘客基因改变相一致（图3）。在12例接受了子宫切除术并分期的POLEmut肿瘤中，75%（9）为早期（FIGO I或II期），25%（3）为晚期（FIGO III期）。在所有FIGO III期POLEmut肿瘤中，淋巴血管间隙浸润被认为是可疑的或明确的；1例伴有卵巢转移（FIGO IIIA），2例伴有盆腔淋巴结转移（FIGO IIIC1）。所有11例经子宫切除术并随访的患者在间隔1-20个月后均无疾病迹象（中位数= 14）。表3总结了POLEmut病例的临床病理特征。

讨论

随着分子分型被纳入NCCN和ESGO/ESTRO/ESP子宫内膜癌指南，以及临床试验数据的累计对风险分层的重要性渐显，分子分型将越来越多地融入妇科肿瘤实践。为了预测这种向更综合的形态学和分子诊断方法的转变，我们建立并实践应用了一个诊断工作流程和报告系统，并描述了我们在EC上进行常规分子分型的机构经验。目前，EC的分子分型主要在临床试验和回顾性研究中进行，尚未纳入常规病理实践。仍需确定一种有效的、具有成本效益的、技术上可行的方法来将EC分层为四个分子亚群。免疫组化已被证明是一种有效的替代标记物，用于识别EC中失配修复基因（如MLH1、PMS2、MSH2和MSH6）和p53的大部分功能改变的丧失，而且免疫组化在大多数病理环境中都是可用的。 

然而，需基于核酸的方法来评估POLE突变状态，这对常规识别这些肿瘤造成了主要障碍，特别是不采用基于新一代测序的其他方法，既昂贵又耗时；而Sanger测序方法，分析灵敏度又很低（单个等位基因突变为20% VAF或>40%肿瘤细胞性）。为了填补当前EC的POLE分子检测的空白，商业公司或实验室很有可能在近几年会研发出单基因POLE试验，用于临床敏感、快速、有效地检测相关致病POLE基因变异，在更广泛采用EC分子分型中扮演关键的角色。在我们的机构，我们开发并验证了一种新型的POLE SNaPshot实验，以查询在POLE的EDM中预先选择的核苷酸位置，以便对EC进行分子分型。

图3

一例多重分型POLEmut-MMRd的EC含有致病性POLE突变，IHC显示亚克隆MSH6缺失。一例POLEmut （p.Phe367Ser）的EC表现出异质形态和免疫组化染色模式，包括A高级别显示区域固态生长，大量肿瘤浸润淋巴细胞；B完整，尽管MSH6表达有所减少；C以及更低级别的腺体生长区域；D免疫组化导致的MSH6表达缺失。在致病性POLE突变导致超突变表型的情况下，免疫组化检测MSH6亚克隆缺失，这可能是由于次级或乘客基因改变的原因。 

我们对所有在我所诊断的EC进行MMR、p53免疫组化和POLE突变检测，以便更好地了解其分子和临床病理特征。在项目启动时，分子分型尚未纳入国家或国际EC准则，而且POLE分子检测的账单和保险范围也存在不确定性。因此，在分子分型的研究和早期实施阶段，所有POLE分子检测的费用全部由机构病理学部门资助（基于价值的护理资助）。自我们开始测试以来，EC的分子分型已被纳入NCCN和ESGO/ esto /ESP指南，我们希望这将在未来带来与EC分子检测相关新的、更一致的保险政策。 

为EC的分子测试确定一种算法可能是机构特有的。Talhouk和同事开发并验证了ProMisE分型（子宫内膜癌的前瞻性分子风险分型），它是基于分步的方法进行分子分型测试。ProMisE分型首先通过免疫组化评估MMR蛋白，以便在阳性时及时转诊进行遗传性癌症检测。MMR蛋白完整则进行POLE EDM突变分析，阴性则进行p53 IHC。这种分步的方法具有成本效益，在大多数情况下可以将EC分层为四组分子亚组；然而，如果首先进行MMR免疫组化，则可能会漏诊POLEmut的EC，特别是提示POLE分子检测的亚克隆模式不明显且未被发现时。此外，分步检测方法可能会导致分子分型的延迟。 

重要的是，将分子检测纳入常规临床工作流程或能改善诊断的再现性和预后，从而改善肿瘤管理。历史上，单独使用形态学评估诊断高级别EC时，观察者之间的一致性较差；然而，分子分型有可能有助于提高诊断的再现性。例如，POLEmut肿瘤可以表现出不明确的组织形态学模式，在形态学上与浆液性癌和透明细胞癌重叠，但肿瘤生物学侵袭性更低，预后更好。在我们的研究过程中，我们发现高级别EC表现出不明确的形态模式，即MMR充分，而p53通过IHC显示为“野生型”或“非异常”。在这些情况下，只有确定了POLE突变状态，才能在分子状态下解释形态学结果，才会发布诊断报告。分子状态对于预测不同EC组织类型的预后越来越重要，包括透明细胞癌、去分化/未分化癌、癌肉瘤和子宫内膜样癌。

在我所310例的队列中，不同分子亚群的分布与文献中报道的相似。其中，POLEmut检测15例（5%），MMRd检测79例（25%），NSMP检测135例（44%），p53abnl检测81例（26%）。POLEmut肿瘤主要集中在6.4%（14/220）的子宫内膜样EC和8%（4/49）的高级别子宫内膜样EC或不明确的高级别癌。值得注意的是，25%（3/12）接受子宫切除术的POLEmut ECs为后期（FIGO IIIA和IIIC）。该队列的局限性之一是随访时间短，排除了任何纵向分析；然而，我们计划继续对这一群体进行前瞻性研究。我们目前方法的另一个潜在限制是，超过8%的病例（n = 27）肿瘤细胞性低（<20%）；因此使用了分析灵敏度更高的方法，对这些肿瘤细胞性低的病例进行了分子检测，这将有助于更明确地确保POLE阴性状态。另外，通过从玻片或取块上进行大解剖来富集肿瘤细胞也可以增加肿瘤细胞的体积。 

在未来，我们将考虑实施肿瘤大解剖来富集这些场景中的肿瘤细胞；然而，这将成为一个更加耗时和需要熟练技术的过程。最后，虽然我们实验室开发的POLE试验对检测EC中更常见的致病性POLE基因变异非常敏感，但该试验不会检测到更罕见的变异。值得注意的是，我们队列中的一个病例显示了p53亚克隆异常，然而，SNaPshot检测没有检测到POLE突变，IHC检测到MMR蛋白完整。很有可能该EC有一个罕见的POLE突变没有被检测到。或者，不能排除其中一种MMR蛋白发生基因改变的可能性，该蛋白仍然通过免疫组化产生野生型的免疫反应模式。根据我们的经验，很明显，有的EC可以受益于更广泛的分子特征，通过下一代测序，更牢固地建立最终的分子分型。 

随着分子分型越来越常规，高效地将分子状态与临床病理特征相结合成为肿瘤学管理的关键。在我们的机构，分子分型报告在两周内，这是一个相对较短的时间框架，没有延误患者的护理。自实施分子分型以来，分子亚群已被纳入肿瘤委员会的介绍和讨论。目前，多机构PORTEC-4a试验正在进行中，通过比较标准方法与基于患者肿瘤分子风险谱的个体化治疗，评估分子状态在确定EC辅助治疗中的作用。PORTEC-4a试验的结果预计将显示，在具有良好分子结构的病例中，降级治疗是否安全且具有成本效益。 

虽然妇科肿瘤学家仍在等待PORTEC-4a的结果数据、改变肿瘤学管理的新建议和指南的发布，但了解EC的分子状态对我所妇科和放射肿瘤学家仍有价值。例如，具有分子状态可以帮助解决另外形态不明确的高级别肿瘤。此外，与IA 2级子宫内膜样EC的p53abnl亚组相比，IA 2级子宫内膜样EC的有良好的预后的POLEmut亚组，单独进行监测而不进行辅助治疗更令人放心。最后，大多数妇科和放射肿瘤学家发现，我们在附录中报告分子分型的标准化方法对于交流检测结果是有效的。可考虑发布第二份独立的分子分型报告，而不是根据电子病历设置和警告而发布增编报告，以避免遗漏分子附录中所载的信息。 

虽然在许多情况下，简化、快速的分子检测方法（如本文所述的方法）可能足够，但通过下一代测序进行更广泛的分子检测仍然是有价值的。例如，临床试验可能需要更广泛的NGS基因组，该基因组在分子上证实了IHC的发现结果，确定了额外的基因改变、微卫星不稳定性和/或肿瘤突变负担（TMB），特别是在转移或复发疾病的情况下。虽然MMR和p53 IHC是MMR （MLH1，PMS2，MSH2和MSH6）和TP53基因分子改变的优秀替代标记物，但仍有一小部分病例单独使用IHC会漏检。 

例如，一些基因改变破坏了蛋白质功能，但仍然导致了IHC的野生型免疫反应模式。此外，NGS还可以检测更多的POLE变异并进一步表征它们。对于罕见的POLE变异，致病性最好结合高TMB突变（100变异/兆碱基）和基因结构或特征确定（如COSMIC突变特征10，展现了TpCpT中C > A突变和T > G突变的链偏向性，与致病性POLE变异有关）。单基因POLE测序工作是否会取得成功，或者我们是否正在朝着针对所有或某些EC亚型的NGS检测组合的方向发展，还有待观察。事实上，这将在很大程度上取决于周转需求、成本和保险报销。 

综上所述，我们报告了我所对所有内部EC进行常规分子分型，并实施临床适用的分子分型和综合报告流程的经验。据我们所知，这是第一个独立于临床试验的EC诊断分子分型的前瞻性应用。 

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