【神麻人智】七氟烷对新生和成年大鼠的长期恐惧记忆影响具有差异

背景

对婴幼儿来说，过早接触麻醉药物对其学习和记忆能力的发展是一个危险因素。据统计每年约有150万婴幼儿接受麻醉，七氟烷是婴幼儿常用的全麻药物。先前有研究表明，婴幼儿过早接触七氟烷会导致学习和记忆障碍。目前尚不清楚接触七氟烷麻醉是否对新生和成年动物会产生不同的影响，其潜在机制也未完全了解。

既往研究发现突触后致密区95 (postsynaptic protein 95, PSD-95)结构域是吸入麻醉药的靶点之一。PDZ结构域的缺失在兴奋性突触和神经元进程的形成具有显著抑制作用。kalirin-7是Dbl(弥漫B淋巴瘤)基因家族中的kalirin蛋白的一个亚型，与PSD-95在突触后致密物质共定位，调节兴奋性突触的发育和成熟。研究表明kalarin-7与PSD-95在突触后致密物质上相互作用，PSD-95参与突触的形成、海马学习和记忆功能，提示kalarin-7可能参与了麻醉药诱导的突触改变，提示麻醉药可以调节突触的形成和认知功能。然而，七氟烷暴露对海马记忆和突触结构的影响及机制目前尚不清楚。

在本研究中作者研究了七氟烷暴露对出生后(PND)第7天新生大鼠和出生后第56天成年大鼠的长期恐惧记忆的影响。此外，作者还探讨了PSD-95及其结合蛋白kalirin-7参与其中的分子机制。

结果

1.七氟烷麻醉能够损害PND 7大鼠海马依赖性恐惧记忆，但对PND 56大鼠无明显影响

为了探讨七氟烷麻醉对PND 7和PND 56大鼠大脑的影响，研究者进行了恐惧条件反射实验，以确定海马依赖性和非依赖性的恐惧记忆。场景恐惧实验结果显示，与空气暴露对照组相比，早期接触七氟烷的PND 7大鼠的躯体僵直反应（freezing）时间显著缩短(Fig.1 b, n = 6, P = 0.0256, t = 2.63)，而接触七氟烷的PND 56大鼠的僵直反应时间与对照组相比没有显著变化(Fig.1 c, n = 6,P = 0.5012, t = 0.6991)。随后，研究者进行了声音实验（tone test），以探究七氟烷对海马非依赖性记忆的影响，研究者发现PND 7和PND 56大鼠与对照组相比，僵直反应时间没有显著变化(Fig.1 d, n = 6 /组, P = 0.7174, t = 0.3450; Fig.1e, n = 6/组，P = 0.8552, t = 0.1875)。 

Fig.1七氟烷暴露会损害PND 7大鼠的海马依赖性恐惧记忆，但对PND 56大鼠没有明显影响。a.实验时间线；b和d. 在环境联系性实验中（b），与对照组相比，七氟烷暴露显著减少了PND 7大鼠的躯体僵直时间，而在声音实验中（d），七氟烷暴露组和空气暴露组没有显著变化(d); c和e .与空气暴露对照组相比，七氟烷暴露在PND 56成年大鼠的环境联系性实验和声音实验中的躯体僵直时间都没有显著变化。n = 6 /组，*P < 0.05 vs. 对照组

2. 早期接触七氟烷的PND 7大鼠突触后致密物质和突触数量显著降低，而PND 56大鼠没有明显改变

为了进一步探讨七氟烷暴露对海马依赖性恐惧记忆的影响机制，研究者采用透射电镜技术对海马突触结构进行了分析。如图2a - d所示，与对照组相比，早期接触七氟烷的PND 7大鼠海马CA1区突触数量、突触后致密物质的长度和厚度均显著减少(n = 3/组，突触数量:P = 0.009, t = 8.76;PSD长度:P = 0.0407, t = 3.098; PSD厚度:P = 0.0172, t = 5.503)。然而七氟烷麻醉对PND 56大鼠海马突触数量、突触后致密物质的长度和厚度与对照组相比没有显著影响(图2e−h, n = 3/组，突触数量:P = 0.2686, t = 1.342;PSD长度:P = 0.0.9287, t = 0.0954;PSD厚度:P = 0.1.22, t = 0.2905)。 

Fig. 2七氟烷麻醉后，PND 7大鼠突触后致密物质和突触数量明显减少，PND 56大鼠没有明显改变。a. PND 7大鼠海马突触超微结构图。b – d.七氟烷麻醉降低了PND 7大鼠突触密度(b)、突触后致密物质长度(c)和突触后致密物质厚度(d)。e. PND 56大鼠海马突触超微结构图。f- h.七氟烷麻醉下PND 56大鼠海马突触密度(f)、突触后致密物质长度(g)、突触后致密物质厚度(h)与对照组比较无明显变化。n = 3 /组。*P < 0.05 vs. 对照组

3.七氟烷麻醉降低kalirin‑7和PSD - 95在发育中大脑中的表达

为了探究突触后蛋白kalirin-7和PSD-95是否参与了七氟烷诱导的记忆障碍，研究者检测了它们在七氟烷麻醉后海马中的表达。研究者观察到PND 7组大鼠海马区kalirin‑7 的表达明显下降(图3a和b, n = 3/组，P = 0.0047, t = 8.477) 。而在PND 56大鼠中，七氟烷组或无七氟烷组中，海马体中Kalirin‑7 的表达均无明显变化(图3c、d, n = 3/组，P = 0.9318, t = 0.0937) 。七氟烷麻醉显著降低了PND 7大鼠PSD-95的表达(图3e和f, n = 3/组，P = 0.0003, t = 13.36)，而PND 56大鼠海马区PSD-95的表达则无明显变化(图3g和h, n = 3/组，P = 0.5534, t = 0.6709)。 

Fig. 3 吸入七氟烷可降低PND 7大鼠海马kalirin-7和PSD-95的表达，而PND 56大鼠无明显变化。Western blot检测七氟烷暴露后PND 7和PND 56大鼠海马区kalirin-7和PSD-95蛋白的表达水平。a – d.七氟烷作用下PND 7大鼠海马kalirin-7表达显著降低(a和b)，而PND 56大鼠海马kalirin-7表达无显著变化(c和d)。e – h.七氟烷吸入显著降低PND 7大鼠海马PSD-95的表达(e和f)，而PND 56大鼠海马PSD-95的表达与对照组比较(g和h)无明显变化。n = 3/ group. *P < 0.05 vs. 对照组 

讨论

在本研究发现早期接触七氟烷的新生大鼠，会损害海马依赖性的恐惧记忆。通过透射电镜技术，研究者进一步发现七氟烷麻醉降低了新生大鼠突触后致密物质和突触数量。此外，研究发现七氟烷暴露不仅显著降低新生大鼠海马突触后蛋白PSD-95的表达，还显著降低其结合蛋白kalirin-7的表达。

目前，尚不清楚七氟烷麻醉是否对海马依赖的情境性恐惧记忆有长期影响。研究结果表明七氟烷暴露对这种恐惧记忆的影响是呈年龄依赖的。PND 7大鼠早期接触七氟烷能显著缩短场景恐惧记忆实验的躯体僵直时间，但七氟烷对成年大鼠的恐惧记忆没有影响，结果表明七氟烷麻醉是发育中的大脑海马依赖性恐惧记忆障碍的危险因素。研究观察到七氟烷对新生大鼠和成年大鼠的声音恐惧记忆都没有改变，表明七氟烷麻醉对海马非依赖的恐惧记忆没有影响。既往已有研究表明七氟烷麻醉不会损害Morris水迷宫测试中的习得性学习和记忆，早期接触七氟烷不会导致儿童时期猴子的学习和记忆障碍。在本研究专门研究了七氟烷麻醉对出生7天以及成年大鼠恐惧记忆的长期影响，但是，之前一项针对青少年小鼠的研究报告了不同结果，吸入七氟烷3h不仅没有降低记忆，反而通过增加海马细胞骨架的组成，增强了长期记忆的巩固。

虽然不同的动物种类可能会产生不同的结果，但更可能是因为七氟烷对处于不同生长发育阶段(包括新生儿、青少年和成年)动物的长期海马认知能力具有不同的影响，已有报道表明吸入七氟烷1h可引起幼鼠高碳酸血症和酸中毒，但对长期认知行为障碍无影响;而当麻醉时间增加到4h时，内环境干扰可能得到补偿，导致长期认知障碍。另一项研究表明成年大鼠接触2.5%七氟烷1h后，运动协调和空间学习和记忆并未受损，这与本研究的发现一致。结果表明2.4%七氟烷对成年大鼠恐惧记忆没有影响，但七氟烷麻醉4h后，PND 7大鼠的长期恐惧记忆受损，进一步表明不同的麻醉敏感性对新生大鼠和成年大鼠的学习记忆有不同的影响。因此，在进行小儿麻醉时应考虑麻醉药的种类和患者的年龄。动物麻醉研究积累的数据提醒我们，儿科患者应该尽量避免长时间麻醉，以免造成长期认知功能障碍。

既往研究表明PND 7大鼠暴露于全身麻醉会导致发育中的海马长期超微结构改变，提示早期暴露于麻醉药可能会导致幼龄动物的突触异常。本研究中发现七氟烷暴露降低了新生大鼠的海马突触后致密物质和突触数量，这与以往的报道一致，七氟烷影响突触可塑性和突触发生。因此，研究者认为早期接触七氟烷会损害发育中的大脑突触结构和功能，从而导致认知功能障碍(如恐惧记忆障碍)。还有研究表明七氟烷麻醉4周龄小鼠后，由于Rac1蛋白和Factin构成的表达增加，导致小鼠长期认知功能增强，提示七氟烷麻醉引起的海马超微结构改变能直接导致动物认知行为的不同。

kalirin-7通过与含PDZ的PSD-95相互作用在突触可塑性中发挥重要作用，并可能参与七氟烷诱导的恐惧记忆缺陷。据报道接触七氟烷可以降低幼龄小鼠的PSD-95。为了进一步研究七氟烷暴露后新生大鼠恐惧记忆障碍的分子机制，研究者检测了kalirin-7和PSD-95在大鼠海马中的表达，PSD-95是一种参与吸入麻醉的突触后蛋白。研究发现七氟烷麻醉降低了新生大鼠海马中kalirin-7和PSD-95的表达。我们知道kalirin-7对突触结构的形成和靶向以及突触的可塑性至关重要，这表明kalirin-7是麻醉药调控突触功能的潜在靶点。因此，研究结果表明，七氟烷麻醉导致幼龄动物海马中kalirin-7和PSD-95的表达降低可能是其诱发海马依赖性恐惧记忆的重要分子机制。既往研究结果显示PSD-95缺失鸟苷酸激酶结构域的突变小鼠，PSD-95缺失并不影响近期恐惧记忆的检索，但影响了恐惧记忆的消退和准确性。因此，PSD-95的不同区域可能对恐惧记忆发挥着不同的作用。

本研究结果表明，在发育中的大脑中，早期接触七氟烷会损害海马依赖的恐惧记忆，这可能是通过七氟烷引起的海马突触结构的改变以及海马突触中kalirin-7和PSD-95表达的降低所介导。

编译、审校：张瑜、罗猛强

原文链接：Li C, Liu S, Mei Y, Wang Q, Lu X, Li H, Tao F. Differential Effects of Sevoflurane Exposure on Long-Term Fear Memory in Neonatal and Adult Rats. Mol Neurobiol. 2022 May;59(5):2799-2807. doi: 10.1007/s12035-021-02629-x.

声明：古麻今醉公众号为舒医汇旗下，古麻今醉公众号所发表内容之知识产权为舒医汇及主办方、原作者等相关权利人所有。未经许可，禁止进行转载、摘编、复制、裁切、录制等。经许可授权使用，亦须注明来源。欢迎转发、分享。