快报| 胸膜结核瘤患者CD4+调节性T细胞（Treg）的表达及调节CD4+T淋巴细胞活化的研究

      Frequency of CD4+ regulatory T cells and modulation of CD4+T lymphocyte activation in pleural tuberculoma

Gao W, Yang N, Ji S, Zeng YTuberculosis (Edinb)，2022, 134: 102210. doi: 10.1016/j.tube.2022.102210. PMID: 35526509

近日，Tuberculosis 杂志发表了一项胸膜结核瘤患者CD4+调节性T细胞（Treg）的表达及调节CD4+T淋巴细胞活化的研究（Gao W, Yang N, Ji S, Zeng Y. Frequency of CD4+ regulatory T cells and modulation of CD4+T lymphocyte activation in pleural tuberculoma. Tuberculosis (Edinb), 2022, 134: 102210. doi: 10.1016/j.tube.2022.102210. Epub ahead of print. PMID: 35526509.）。该研究主要由南京中医药大学附属南京医院，南京第二医院结核科完成，研究发现Treg在胸膜结核瘤（tuberculoma ，PTM)患者中表达增加，经治疗后开始下降至正常，提示Treg在PTM的免疫反应中发挥重要调节作用。南京市第二医院结核科高卫卫为文章的第一作者，南京市第二医院结核科曾谊为文章的通信作者。 

研究背景

      胸膜结核瘤（tuberculoma ，PTM)是指胸膜的结核性病变，随着纤维结缔组织增生、胸膜粘连、干酪样坏死灶逐渐包裹，最终局部吸收浓缩为纤维组织包裹的干酪样肿块。PTM多发生于结核性胸膜炎后，主要表现为局限于胸膜下的圆形或类圆形阴影。如治疗不及时，部分病灶瘤体破裂、脓胸流入胸腔，导致结核性脓胸，内科难以彻底治愈，需手术切除，一方面，对患者造成严重的创伤，同时也大大增加患者的医疗费用。目前，PTM的发病率不断上升，但其发病机制仍不清楚。在结核的免疫应答中以CD4+T淋巴细胞为主的适应性免疫应答处于核心地位，它通过不同的细胞亚群参与结核的免疫反应。调节性T细胞 (Treg)是具有免疫抑制功能的CD4+T细胞亚群，Treg通过细胞-细胞接触、分泌抑制性细胞因子等机制抑制效应T细胞(effector T cell，Teff）发挥免疫防御作用。Treg的免疫调节功能在自身免疫疾病和肿瘤的免疫调节作用中研究较多，在结核病的免疫调节中有研究显示，与健康对照组和耐多药结核病患者相比，活动性结核病( active tuberculosis，ATB)的外周血Treg水平升高，同时在结核病变部位(如胸腔积液、腹腔积液、心包积液和支气管肺泡液以及结核淋巴结)中呈高表达状态。同时也有研究表明，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)特异性CD4+T细胞活化标志物如CD38+和HLA-DR+在ATB中的表达明显高于潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection，LTBI)患者，可用于鉴别ATB和LTBI。然而，缺少关于Treg在PTM中免疫调节的研究。本研究通过流式细胞术检测PTM患者与健康对照组的Treg的表达水平和CD38+、HLA-DR+表达，探讨Treg在PTM中的免疫调节作用。 

研究方法

      本研究纳入56例PTM患者和50名年龄、性别和体重指数（BMI）匹配的健康对照组。PTM患者的治疗包括化疗3-6HRZE (S)/ 6-12HR（异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺3-6个月，异烟肼、利福平 6-12个月）和手术（经胸腔镜切除病灶）。通过计算机断层扫描（CT）评估PTM的严重程度和治疗效果，药物治疗6个月后为治愈。流式细胞学技术检测患者外周血淋巴细胞亚群、Treg (CD4+CD25+FOXP3+)以及不同T淋巴细胞亚群的活化标志物CD4+CD38+HLA-DR-、CD4+CD38-HLA-DR+和CD4+CD38+HLA-DR+的表达。 

研究结果

      1. 本研究共纳入56例PTM患者和50名健康对照者

      2组患者年龄、性别、BMI、CD3+T（1302.43±350.26 vs. 1448.98±420.70）、CD4+T（713.91±198.50 vs. 732.80±203.79）、CD8+T（535.23±177.77 vs. 600.80±231.54）绝对计数均无统计学差异 (P > 0.05)；PTM患者CD4/CD8比值明显高于健康者(1.41±0.38 vs.1.23±0.48，P = 0.036)（见图1）。2组患者的一般资料及T淋巴细胞亚群、T淋巴细胞亚群活化的表达见表1。

   图1 流式细胞术检测CD4+T细胞HLA-DR+和CD38+表达

表1  2组患者的一般资料及T淋巴细胞亚群、T淋巴细胞亚群活化的表达

      2. Treg表达分析

通过流式细胞学检测，PTM患者外周血中CD4   + Treg细胞的比例明显高于对照组（(6.60 ± 2.26% vs. 4.22 ± 1.55%，   P < 0.001；Table 1）。而经过6个月的化疗显著下降（从6.46±1.47%下降至5.19±1.70%，   P = 0.011），经过手术治疗后（从6.29±1.89%下降至5.08±1.17%，   P = 0.033）（图2），且化疗和手术治疗后Treg 的比例无差异（5.19±1.70% vs. 5.08±1.17%，   P = 0.824，见图2）。

图2 (a) PTM患者和健康对照组CD4+CD25+FOXP3+T的表达；(b)治疗前PTM 与药物和手术治疗CD4+CD25+FOXP3+T细胞的表达；(c)药物与手术治疗后CD4+CD25+FOXP3+T细胞的表达。

      3. PTM患者CD4+T细胞中CD38+和HLA-DR+水平升高

      本研究通过检测CD38+和HLA-DR+的表达评估CD4+T细胞的活化水平。结果显示，PTM患者CD4+ T细胞表达CD38+和CD38+HLA-DR+的比例显著高于健康对照组（42.79±12.20% vs. 37.20±12.68%，P=0.023，21.84±13.07% vs. 15.34±1.39%，P= 0.008）（见表1和图3）。Spearman相关分析显示，CD4+CD38+HLA-DR +细胞表达与Treg表达呈正相关 (r = 0.367, P= 0.005)，但Treg的表达与CD4+CD38+、CD4+HLA-DR+的相关性无显著性差异（P > 0.05，图4）。

CD38+和HLA-DR+的表达在PTM患者中升高。(a)与健康对照组相比，PTM患者CD4+ T淋巴细胞活化标记物CD38+的表达升高明显，差异有统计学意义。(a)与健康对照组相比，PTM患者CD4+ T淋巴细胞活化标记物HLA-DR+的表达无统计学有差异。(c) 与健康对照组相比，PTM患者表达CD4+CD38+HLA-DR+T细胞在CD4+T细胞中的表达升高明显，差异有统计学意义。

图3 与对照组相比，CD4+ T淋巴细胞细胞活化标记物

图4  PTM患者外周血T细胞亚群活化比例与Treg的相关性分析。(a) CD4+CD38+HLA-DR-，(b) CD4+CD38-HLA-DR+，(c) CD4+CD38+HLA-DR+细胞与Treg表达的相关性。 

研究结论

       PTM是一种少见的胸膜结核，PTM影像学表现为单发、少数为多发，形态有椭圆形、“D”字形、乳头状以及圆形病灶，增强CT可见包膜强化、病灶内部坏死的瘤样病灶。目前对PTM的研究多为病例报道，其发病机制尚不清楚，所以针对PTM的发病机制的研究对该病的诊断和治疗具有重要意义。

       之前的研究表明，T淋巴细胞通过其不同的细胞亚群参与机体的免疫反应，在适应性免疫反应中，Treg通过主动调节T细胞的活化和增殖，从而调节免疫。有研究发现，在ATB中，外周血和结核病变部位Treg和FoxP3 mRNA表达均增加，此外，ATB经治疗后Treg表达恢复正常，从而维持结核病的免疫稳态。虽然Treg介导的免疫调节功能在结核病中研究较多，但在PTM中Treg的表达以及起免疫调节功能目前缺少研究。本研究发现，PTM患者外周血中Treg明显多于对照组，且PTM中Treg的表达在化疗6个月后及手术切除2个月后恢复正常，提示Treg可用于PTM的治疗及预后的评估指标。本研究结果与Wolday等人的研究一致，其研究结果显示，Treg在慢性感染患者的体内升高，包括结核病、寄生虫病等。在结核感染的局部免疫微环境中，活化的CD4+ T细胞通过不同的T细胞亚型，分泌不同的细胞因子参与免疫反应，之前的研究表明，与健康对照相比，ATB患者 CD4+T细胞表达CD38+和HLA-DR+以及其他免疫标记物（如CD153）显著上调，与LTBI患者相比，ATB或肺外结核患者的Mtb特异性CD4 T细胞中HLA-DR、CD38和Ki67的表达显著上调。本研究结果显示，与健康对照组相比，PTM患者的CD4+CD38+和CD4+CD38+ HLA-DR+细胞表达升高，且Treg表达与PTM患者CD4+CD38+HLA-DR+细胞表达密切相关。总之，我们观察到PTM患者的 Treg和CD4淋巴细胞活化高于健康对照组，此外，在PTM中，免疫激活与Treg表达呈正相关。进一步探讨Treg在PTM中的免疫调节作用可为PTM发病机制的研究提供重要依据。 

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编辑：王   然

审校：郭   萌

发布日期：2022-05-26

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