用手机检测新冠病毒核酸？基于CRISPR的核酸检测技术让人大开眼界 | 述评

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近年来，CRISPR/Cas技术飞速发展，基于该技术发展的分子检测方法具有快速、灵敏、特异、廉价等特性，已广泛应用于生命科学领域，尤其在病原体检测领域发展迅速。目前用于呼吸道病原体检测的主要有CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13等系统。

CRISPR/Cas13检测系统，张锋等 [8] 开发了一种基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK技术，为SARS-CoV-2提供了快速准确的诊断方法。通过使用合成的SARS-CoV-2的RNA片段，设计并检测了2个可识别SARS CoV-2特征的sgRNA，激活Cas13酶活性，切割报告分子，产生信号 （图3） 。该技术最后需要将试纸条浸入反应体系中，通过辨识条带位置的不同来确认是否感染SARS-CoV-2。

图3 CRISPR/Cas13检测系统 

诺贝尔奖获得者Doudna等 [9] 报道了一种CRISPR/Cas13a和手机直接检测新冠病毒的RNA的方法 ，这是一种简便且便携的检测方法，实现从采样到检测的一体化。该装置通用小型精简的手机摄像头进行荧光测试。此外，因为手机摄像头具有高灵敏度、强连接性以及GPS和数据处理功能，所以这是一种可以应用到资源匮乏地区的实用工具，有助于即时检测 （图4） 。

 图4  基于手机的CRISPR/Cas13核酸检测系统 

在CRISPR/Cas12检测系统，美国加州大学研究人员开发了一种基于CRISPR/Cas12的快速检测SARS-CoV-2的方法，称为DETECTR （DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter） 的病毒传感器。该方法具有与qRT-PCR相当的准确性，具有无需加热循环、快速、单核苷酸靶标特异性、无需复杂的实验室设备等优势 [10] 。 

此外，复旦大学牵头的研究团队报道了一种基于CRISPR/Cas12的“多相复式非连续生产法”用于检测SARS-CoV-2，俗称“一锅法” （opv CRISPR） ，是将逆转录环介导等温扩增技术 （RT-LAMP） 及Cas12a剪切整合到一个反应体系中完成检测 （图5） 。在SARS-CoV-2潜在感染的临床样本的检测中，用opv CRISPR方法得到的结果和中国疾病预防控制中心批准的RT-PCR的检测结果达到100%的一致。这种“一锅法”的形式，可以完全避免扩增子的污染，实验操作步骤也被大大简化，具有很好的临床应用前景 [11] 。

图5 CRISPR/Cas12检测系统

虽然基于CRISPR/Cas的检测技术发展迅速，但是仍然存在一些障碍和局限性需要研究解决，首先受到PAM序列特点的影响，sg RNA设计的灵活性有限，设计相对复杂；其次CRISPR/Cas 系统识别目标位点以外的其他位点，产生“脱靶”效应，导致检测结果出现假阳性；因此，除了对现有CRISPR/Cas的诊断技术继续优化外，仍需发现、发展新型的CRISPR/Cas诊断系统，或与其他方法进行整合以提高应用的普适性，从而确保其具有良好的临床适用性。

【参考文献】

[8] Joung J.Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot Testing. N Engl J Med,2020. 383(15): 1492-1494.

[9]Fozouni P. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell, 2020???.

[10] Broughton JP. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol,  2020,38(7): 870-874.

[11] Wang R. opvCRISPR: One-pot visual RT-LAMP-CRISPR platform for SARS-cov-2 detection. Biosens Bioelectron,2021,172: 112766.

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编辑 | 骆秉涵 王迪

原文以《呼吸道传染病病原体快速检测新技术与研究开发重点》为题发表在《临床实验室》杂志2022年5月刊专题“分子诊断”述评版块