MRD定制化panel用于临床研究的策略

MRD指肿瘤患者接受根治性治疗后即便达到完全缓解（CR），体内仍然残存有肿瘤细胞的状态。这个概念首先是出自血液病，在血液病的治疗过程中我们发现，在大量的化疗治疗后，在血液里面还能检测到癌细胞，由于残留的细胞数量较少无法在影像学中检测到，所以称之为微小残留病灶。 在2021年6月发布的《非小细胞肺癌分子残留病灶专家共识》中，定义肺癌分子残留病变为经过治疗后，传统影像学（包括PET/CT）或实验室方法不能发现，但通过液体活检发现的癌来源分子异常。这些分子残留病变代表着肺癌的持续存在和临床进展可能。肺癌MRD的检测具有多项功能，可用于患者的预后预测、风险分层、复发监测、疗效评估等，从而实现非小细胞肺癌患者围术期的全程动态监测管理。但因为微小残留病灶极小或残留肿瘤细胞量极少，通过传统影像学或其它实验方法已经很难检测到，因而需要更加灵敏的检测技术。

图1 MRD检测发展历程

随着循环肿瘤DNA(ctDNA)技术的飞速发展，应用ctDNA检测实体瘤MRD已经成为当前的热点。   

一、微小病灶残留临床检测策略

目前，对于微小病灶残留的检测，主要包括三大类： （1）基于固定组成的大panel：使用类似TMB的大panel进行大范围的ctDNA检测，如吉因加、世和、和瑞的固定化panel；优势在于开发成本低，可实现高通量生产，但能保证的单点测序深度较低。 （2）基于定制化的小panel：使用个性化定制的panel（多为多重PCR）对某几个位点进行检测（一般8或16个），可实现>10000×的测序深度，如华大，Guardant，GRAIL等；优势在于测序成本低，单点深度高，但需要针对患者进行个性化定制，开发成本较高。 （3）联合SNP和甲基化检测的panel：在前两者基础上，联合甲基化检测对tumor来源的ctDNA进行组织定位，从而提高准确性。目前国内主要以燃石为代表。

图2 MRD检测主要技术路线

从微小残留病灶的临床性质可知，释放入血的ctDNA含量极其微量，无论是哪种方法，都需要对超低丰度的ctDNA有着较好的敏感性。Asaf Zviran等人建立了输入的血浆量与检测到的tumor肿瘤数量的双端皮尔逊检验模型，发现二者具有相关性，从而证明了input核酸量时限制靶向测序突变检测的潜在限制因素。同时，他们证明了WGS可以获得比靶向捕获测序更高的突变检出率。基于这一研究结果，用测序广度替代测序深度来克服cfDNA低起始量是可靠的，MRDetect即基于该原理进行开发，灵敏度可达10^-5。 然而，MRDetect采用WGS的方法进行检测，意味着将导致巨大的检测成本，不利于MRD需要长期随访动态检测的特性。因而，目前的定制化方法大多采用广度和深度结合的策略。一般，对肿瘤组织进行WES或较大panel的广度筛选，从中挑选若干有意义的体细胞突变，设计定制化的小panel，使用这些小panel对血液中cfDNA进行检测。这种方案兼顾了不同患者之间的差异性与检测本身的精确性，已经逐渐成为国外各个基因检测公司的首选，目前Natera的IVD产品即基于该方法。

基于LC目前技术平台的实际情况，Natera的方法具有较高的可信性：即先基于Agilent or IDT的全外显子探针对患者的肿瘤组织(FFPE)进行检测，从中挑选出有意义的体细胞突变，基于Variant Pro系统进行定制化panel设计（需带有UMI），预期检测0.02%级别以上的ctDNA突变。   

二、微小病灶残留检测的临床意义

目前，临床上对MRD检测的意义包括以下三类：

（1）根据MRD检测结果预测用药疗效 传统的ctDNA检测已经被广泛地应用在用药疗效检测上，典型的如血液EGFR T790M突变被用于指示EGFR 一代TKI的耐药。在此基础上，有更多的证据证明，ctDNA残留水平可以指示更多的药物疗效。Powles T等人发现，ctDNA阳性患者接受atezolizumab得到了改善，而ctDNA阴性组没有显著差异；6周后，atezolizumab组的ctDNA清除率高于对照组（18% vs 4%）；同时，复发相关的基因在两组之间也发生了差异表达。Bratman S V等人发现，ctDNA在免疫检查点抑制剂（ICB）治疗前后发生的变化，可以指示ICB的疗效：ctDNA清除率高的患者意味着较好的ICB应答。

（2）根据MRD检测结果监控肿瘤复发 肿瘤复发来源于体内未被清楚的癌细胞，因而，检测癌细胞释放的ctDNA通常比传统的放射检查（如CT）更早地发现复发的肿瘤。Charles Coombes等人在49位乳腺癌患者中持续检测血液ctDNA突变情况，显示ctDNA阳性的患者，预后显著差于阴性患者，且随着时间进展，ctDNA阳性患者的突变VAF会逐渐升高，证明了cfDNA图谱可以用于检测乳腺癌复发。Tarazona N等人检测了150位局限性结直肠癌患者的血液ctDNA变化，并进行ddPCR验证，证明了ctDNA的存在与早期复发相关，比放射性检查要早；且追踪至少2种突变可以提高MRD的识别能力到87.5%；同时证明了在连续的血浆样本中使用多个突变跟踪可以提高MRD的准确性[5]。这一结论也支持了需要采用多个突变位点进行高深度测序来监控MRD。Chaudhuri A A等人利用CAPP-Seq进行超深度测序，证明MRD可以可靠鉴别肿瘤复发，且72%的患者ctDNA进展比放射学进展快5.2个月。 对于一些没有热点突变的癌种，MRD检测同样具有指导预后的能力。Lee B等人首次提出对于没有生物标志物来指导治疗方案选择时，可以评估cfDNA的变化来指导预后：在胰腺癌患者中，他们发现检测到ctDNA的患者（13/13）均发生了复发，表明cfDNA在术前术后的变化可以作为一个预后治疗，可以对术后检测ctDNA阳性的患者进行强化治疗策略。

（3）根据MRD检测结果联合分析无复发生存期（RFS）和总生存期（OS） MRD不仅可以作为一种生物标志物指导复发的可能性，也可以作为预后指标用于预测患者的无进展生存期和总生存期。Bratman S V等人采用△ctDNA联合传统的RECIST模型可以提高Cox模型预测OS的准确性，ctDNA阴性代表着更好的预后。Peng M等人采用cSMART技术检测非小细胞肺癌肿瘤组织中的体细胞突变和血浆中的MRD，并采用kaplan-meier和Cox回归分析评估RFS和OS，证明ctDNA的检出与RFS和OS负相关。   

三、微小病灶残留检测相关临床试验设计

Maria Coakley等人在Clinical Cancer Research上发表了关于MRD临床试验设计的具体策略，具体如下： （1）实体瘤切除后辅助治疗疗效尚不确定的癌种（如II期结直肠癌） ① 随机型：将入组病例随机分为两组，一组进行常规的辅助化疗；另一组基于MRD检测结果，ctDNA阳性患者进行辅助化疗，ctDNA阴性患者不进行干预，并持续检测MRD水平。保持随访，评价无病生存期（DFS） ② 非随机型：对入组病例进行MRD检测，对ctDNA阳性患者进行化疗，ctDNA阴性患者不进行干预并持续检测MRD水平。保持随访，评估无病生存期。 该类研究主要证明ctDNA阴性具有较好的预后，且化疗并不能使他们获得DFS益处。通常采用随机型试验，非随机型试验需要的入组病例更低，但必须要求肿瘤具有较低的复发风险基线。

图3 辅助治疗尚不确定的癌种临床试验设计

（2）实体瘤切除后具有标准辅助治疗策略的癌种 ① 随机型：对入组病例进行MRD检测，ctDNA阴性患者继续进行标准治疗；ctDNA阳性患者随机分成2组，一组在标准治疗基础上增加额外治疗，而另一组在标准治疗基础上增加安慰剂处理。持续随访验证ctDNA清除是否可以替代DFS作为研究终点 ②非随机型：对入组病例进行MRD检测，ctDNA阴性患者继续进行标准治疗，ctDNA阳性患者在标准治疗基础上增加额外治疗。持续随访，验证ctDNA的清除情况。 该类研究主要用于指导额外的治疗手段是否需要进行。通常采用随机型的方法，只有当ctDNA已经被证明可以替代DFS作为研究终点时，可以采用非随机型的方法。同时，ctDNA的检测结果也可以作为疾病的分型参考指标。

图4 具有标准辅助治疗策略的癌种临床试验设计

（3）高风险恶性实体瘤

一般采用随机型试验，将入组病例随机分为两组，一组采用传统的辅助治疗，另一组采用传统辅助治疗和新的治疗手段，对两组均进行持续的MRD检测，评价MRD检出情况和DFS。 该类研究主要用于证明MRD检出情况可以替代DFS作为药物开发临床试验的替代终点，从而缩短临床药物的审批时间，加速药物开发流程，因而一般需要和药厂联合开展临床试验。

图5 高风险恶性实体瘤临床试验设计

Reference

[1] Zviran A ,  Schulman R C ,  Shah M , et al. Genome-wide cell-free DNA mutational integration enables ultra-sensitive cancer monitoring[J]. Nature medicine, 2020, 26(7):1-11.

[2] Powles T ,  Assaf Z J ,  Davarpanah N , et al. ctDNA guiding adjuvant immunotherapy in urothelial carcinoma[J]. Nature.

[3] Bratman S V ,  Yang S ,  Iafolla M , et al. Personalized circulating tumor DNA analysis as a predictive biomarker in solid tumor patients treated with pembrolizumab[J]. Nature Cancer.

[4]Personalized Detection of Circulating Tumor DNA Antedates Breast Cancer Metastatic Recurrence[J]. Clinical Cancer Research, 2019.

[5] Tarazona N ,  Gimeno-Valiente F ,  Gambardella V , et al. Targeted next-generation sequencing of circulating-tumor DNA for tracking minimal residual disease in localized colon cancer[J]. Annals of Oncology, 2019, 30(11):1804-1812.

[6] Chaudhuri A A ,  Chabon J J ,  Lovejoy A F , et al. Early Detection of Molecular Residual Disease in Localized Lung Cancer by Circulating Tumor DNA Profiling[J]. Cancer Discovery, 2017, 7(12):1394.

[7] Lee B ,  Lipton L ,  Cohen J , et al. Circulating tumor DNA as a potential marker of adjuvant chemotherapy benefit following surgery for localised pancreatic cancer[J]. Annals of Oncology, 2019, 30(25).

[8] Peng M ,  Huang Q ,  Yin W , et al. Circulating Tumor DNA as a Prognostic Biomarker in Localized Non-small Cell Lung Cancer[J]. Frontiers in oncology, 10:561598.

[9] Coakley M ,  Garcia-Murillas I ,  Turner N C . Molecular Residual Disease and Adjuvant Trial Design in Solid Tumors[J]. Clinical Cancer Research, 2019, 25(20):clincanres.0152.2019.