结石 基础研究（16）：大分子在肾结石形成中的作用

Case Reports

Hinyokika Kiyo

. 2021 Sep;67(9):419-421.

 doi: 10.14989/ActaUrolJap_67_9_419.

[A Case Report of 2,8-Dihydroxyadenine Urolithiasis]

大分子在肾结石形成中的作用

晶体聚集体的形成是肾结石发病机制中的关键过程之一，涉及晶体（主要是一水草酸钙，COM）和尿液成分（例如蛋白质）之间的相互作用，这些成分充当结石中晶体之间的粘合剂“胶水”。为了更好地了解导致晶体聚集的蛋白质-晶体相互作用，我们使用三种合成聚阴离子测量了模型蛋白对散装 COM 晶体特性以及它们在晶体表面的吸附的影响：聚（天冬氨酸）（polyD )、聚谷氨酸 (polyE) 和聚丙烯酸 (polyAA)。这些阴离子大分子将散装溶液中 COM 晶体聚集的量减少到与正常尿液中蛋白质混合物观察到的相似程度，聚合物之间几乎没有差异。相比之下，聚合物在 COM 晶体生长的测量中表现出差异。聚（精氨酸）（polyR）和聚（赖氨酸）（polyK）等聚阳离子微弱地减少了聚集，对晶体生长的影响可以忽略不计。发现所有聚离子都与 COM 晶体表面相关，这可以通过电泳迁移率测量中 COM 晶体的 zeta 电位变化来证明。另一方面，聚阳离子和聚阴离子的许多二元混合物可以促进 COM 聚集和可能的生长，这似乎是由聚合物聚集体形成而不是晶体电荷稳定性的丧失所介导的。类似地，晶体聚集促进行为可以通过形成弱电荷聚阴离子的聚集体来驱动，如 Tamm-Horsfall 蛋白，表明聚合物（蛋白质）聚集可能在结石形成中起关键作用。聚阴离子-COM 晶体表面相互作用对聚合物侧基化学成分的敏感性通过 polyD 和 polyE 之间晶体聚集行为的巨大差异来证明，这与原子力显微镜 (AFM) 测量各种 COM 表面上的生长抑制和化学力相关显微镜 (CFM) 测量 COM 晶体表面和用羧酸盐或脒基部分装饰的 AFM 尖端之间的解结合力（分别模拟聚阴离子和 polyR 侧链）。与 polyD 相比，在 COM (100) 表面上 polyE 缺乏强相互作用似乎是关键差异。最后，聚阴离子和聚阳离子的同时存在似乎改变了聚阳离子在 CFM 中介导解结合力和促进晶体生长的能力。总之，聚阴离子与 COM 表面密切相关并影响结晶，而聚阳离子则没有，尽管基于聚阴离子的物理化学性质观察到重要差异。观察结果表明，聚合物聚集体的形成促进了聚阴离子-聚阳离子混合物和弱电荷聚阴离子的 COM 聚集，这在桥接晶体表面中起关键作用。尽管基于聚阴离子的物理化学性质观察到重要差异。观察结果表明，聚合物聚集体的形成促进了聚阴离子-聚阳离子混合物和弱电荷聚阴离子的 COM 聚集，这在桥接晶体表面中起关键作用。尽管基于聚阴离子的物理化学性质观察到重要差异。观察结果表明，聚合物聚集体的形成促进了聚阴离子-聚阳离子混合物和弱电荷聚阴离子的 COM 聚集，这在桥接晶体表面中起关键作用。

关键词：肾结石，草酸钙，原子力显微镜，粘附，聚集，聚电解质

1.0 简介

几十年来，表征尿液大分子的作用一直是结石研究的主要焦点，发表了许多关于该主题的评论[ 1-4 ]。从第一次发现大分子作为石基质[ 5 ]的主要成分开始，大多数研究都集中在蛋白质上，其中蛋白质占 ca。基质质量的 65%；然而，在尿液和结石基质中发现的糖胺聚糖和其他多糖也受到了关注[ 6 – 9 ]然而，在尿液和结石基质中许多来自各种植物产品和提取物的顺势疗法药物被认为含有结石形成的多糖抑制剂[10 - 12 ]。RNA和DNA等大分子也存在于结石中，尽管含量非常低，因此很少受到关注。超分子组装体，例如包含细胞膜的脂质双层，也可以以类似于大分子的方式发挥作用，因为它们包含与可以共同与晶体或石头表面相互作用的官能团的界面。在这些例子中，定义明确的结合部分的存在表明了大分子在结石发病机制中的作用的一般模型，这构成了结石形成机制的主要知识空白。

本文的讨论仅限于含有草酸钙 (CaOx) 作为这些微晶聚集体的主要结晶成分的结石。大约 75% 的分析结石含有一水草酸钙 (COM)、二水草酸钙 (COD) 或这两种相的混合物的晶体。大多数 CaOx 结石形成者没有明显的代谢紊乱，这表明大分子在 CaOx 结石形成中起主要作用。虽然不同相的磷酸钙晶体（即羟基磷灰石、碱式磷酸钙和透钙磷石）经常作为次要成分在结石中发现，但它们不太常见地占结晶部分的大部分，并且通常它们只是结合在一起的主要成分具有潜在的疾病过程。同样，尿酸的结晶相，鸟粪石（磷酸铵镁）和 L-胱氨酸常见于结石中，仅与特定的生理紊乱有关。在这些情况下，大分子在触发这些结石形成方面可能不太重要。

蛋白质和其他有机成分几乎覆盖在 CaOx 结石中每个微晶的每个表面[ 13 ]，尽管总有机物含量通常仅为 2-3%（按重量计）[ 14-16 ]。采用蛋白质组学方法的最新研究表明，在 CaOx 结石中发现了数百种蛋白质，并且许多相同的蛋白质存在于其他类型的结石中[ 17 – 24 ]. 在其他石头类型中，基质成分往往占总石头质量的较大部分（Neil Mandel，私人通讯），但通常对不同石头类型中基质成分之间的差异知之甚少。因此，本文对与 CaOx 的大分子相互作用的强调与最常见的结石有关，但对其他结石类型的普遍适用性尚不确定。

肾结石的形成是生物矿化的一种形式，在自然界中无处不在。生物矿化的一个常见过程是控制大分子和晶体表面之间的相互作用，这被认为是由多价离子促进的，多价离子在通常形成的钙基晶体中桥接蛋白质和离子之间的相反电荷基团[ 25 , 26 ]。值得注意的是，蛋白质会影响生命系统中的钙化，例如软体动物壳、人体骨骼和血管斑块（例如动脉粥样硬化）的形成[ 27 – 29 ]. 在肾结石的情况下，尿液成分和 CaOx 晶体之间的相互作用可能会影响结石发病机制中的一个或多个关键过程，包括晶体成核、生长、聚集以及晶体和/或聚集体与肾脏上皮表面的附着[ 30 ] . 各种尿液成分已成为晶体聚集和细胞附着的可能抑制剂，特别是阴离子蛋白和糖胺聚糖[ 31 – 34 ]。然而，在一些研究中，据报道，尿液大分子也可促进 COM 聚集和/或附着于上皮细胞[ 35 – 37 ]. 促进晶体粘附的细胞模型中磷脂层的改变是大分子相互作用的另一个表现[ 38 ]。天然存在的大分子的这些不同作用已在多个场合进行了审查[ 17 , 39 ]，但有助于该过程的蛋白质数量使数据的进一步解释变得复杂。

本综述将重点关注探索构成结石的微晶 CaOx 聚集体形成的基本过程的报告，包括以前未报道的实验结果，这些实验为理解结石形成提供了框架。认识到据报道可抑制 COM 结晶的大多数天然蛋白质都含有高比例的天冬氨酸和谷氨酸残基（高达 40%）[ 40 ]，我们已经广泛研究了图1. 体外研究表明，具有羧酸盐官能团的聚电解质与 COM 表面有很强的相互作用，并且对草酸钙结晶过程的影响类似于正常尿液中的尿蛋白[ 41-43 ]。聚阴离子蛋白质从溶液中吸附到 COM 晶体表面可以通过改变晶体习性、抑制生长和引导 CaOx 结晶向 COD 方向来抑制结石形成；一种热力学上不太稳定的晶体结构，在结石形成中似乎不太活跃[ 43 , 44 ]. 另一方面，聚阴离子与 COM 表面的相互作用可以通过促进 COM 晶体附着到肾脏细胞表面[ 45-47 ]或通过自缔合（例如聚阴离子聚集）诱导 COM 聚集来促进与结石形成相关的过程[ 48 , 49 ]或通过其他聚合物聚集过程（例如，聚阴离子-聚阳离子聚集体的形成）[ 49 ]。相反，很少有阳离子大分子与 COM 晶体强烈相互作用的例子被报道[ 50 ]，尽管它们在聚阴离子-聚阳离子聚集体形成中起关键作用，从而导致 COM 聚集[ 49 ]。此外，阳离子侧链似乎对晶体生长加速至关重要，正如一些两亲蛋白所观察到的那样[ 51 ]。总的来说，体外研究表明聚合物-聚合物和聚合物-晶体相互作用对结石形成都很重要。

图1

阴离子和阳离子聚电解质模拟常见尿蛋白的氨基酸残基。COM 结石形成的推定抑制剂富含天冬氨酸和谷氨酸氨基酸，它们相差一个亚甲基。聚(丙烯酸) (polyAA) 是一种合成聚合物，其含有羧酸侧链，其位置比在 polyD 和 polyE 中观察到的更接近聚合物主链。体内研究表明，与精氨酸 (polyR) 和赖氨酸 (polyK) 类似的富含阳离子氨基酸的尿蛋白与结石形成（即组蛋白）无关，尽管它们在结石基质中观察到。

2.0 实验方法

2.1 材料

使用 HEPES（钠盐，99%，Acros Organics）和来自 Sigma Aldrich 的以下试剂制备一水合草酸钙 (COM) 晶体：草酸钠（Na 2 C 2 O 4，≥ 99.5%）、二水合氯化钙 (CaCl 2 ·2H 2O, ≥ 99 %) 和氯化钠 (NaCl, ≥ 99 %)。这些研究中使用的聚电解质购自 Sigma Aldrich（具有不同分子量的多个不同批次）：聚 AA 偏钠盐、聚 D 钠盐、聚 E 钠盐、聚 K 氢溴酸盐和聚 R 盐酸盐。使用来自 Sigma Aldrich 的 11-巯基十一烷酸 (95%) 和巯基乙基胍半硫酸盐对原子力显微镜 (AFM) 研究中使用的悬臂进行了改性。所有试剂均按原样使用，无需进一步纯化。

2.2 一水草酸钙结晶

用于 AFM 分析的 COM 晶体是通过旨在最大化 (100) 表面的程序合成的。通过首先将NaCl溶解在去离子水中，然后在搅拌下加入2mL 10mM CaCl 2在玻璃小瓶中制备20mL组成为1.0 mM CaCl 2 : 1.0 mM Na 2 C 2 O 4 : 150 mM NaCl的溶液。在加入 2 mL 的 10 mM Na 2 C 2 O 4之前，将样品瓶密封并在 60°C 的烘箱中放置一小时滴加，然后将样品放回烘箱中至少 48 小时，以使 COM 完全结晶。用于生成具有大 (010) 和 (12-1) 面的 COM 晶体的详细程序在之前的论文中有所报道[ 52 ]。

通过混合 10 mM CaCl 2和 Na 2 C 2 O 4储备溶液合成用于聚集测定的 COM 晶体“种子”以 1 mL/min 的速率（总体积 = 4 L），然后在室温下搅拌一周。通过重力使晶体沉降，其中吸出上清液并通过低速离心回收晶体。晶体用甲醇洗涤两次并在空气中于65℃干燥。使用粉末 X 射线衍射（由 Neil Mandel，Mandel International Stone and Molecular Analysis Center，Milwaukee，WI）确认一水合物晶体结构。通过将干燥晶体悬浮在缓冲溶液（10 mM HEPES 和 150 mM NaCl，pH 7.5）中制备 1.5 mg/mL 晶种储备溶液，使用前连续搅拌 3 周。

2.3 AFM 化学力显微镜测量

AFM 测量使用 Asylum Research MFP-3D Stand Alone 仪器（加利福尼亚州圣巴巴拉）进行。氮化硅悬臂（Veeco Probes，NP 模型）用于所有化学力显微镜 (CFM) 测量。悬臂弹簧常数是通过热法[ 53 ]测量的，其产生的值在制造商报告的值的 ±50% 范围内 (0.12 N/m)。使用既定程序[ 52 ]将官能团固定在 AFM 尖端上，其中尖端表面涂有 5 纳米铬层，然后是 30 纳米金。使用 11-巯基十一烷酸 SH(CH 2 ) 10 COO立即将吸头浸入 1 mM 硫醇溶液（乙醇中） -立即将吸头浸入 1 mM 硫醇溶液（乙醇中）, 和巯基乙基胍, SH(CH 2 ) 2 NHC(NH 2 ) 2 + , 分别用羧酸根和脒基团对 AFM 尖端进行功能化。

所有 CFM 测量均在 0.11 mM 草酸钙 (CaOx) 溶液中进行。首先对 COM 晶体的 (100) 表面进行成像，以定位合适的区域进行力测量。通过轻轻接合尖端并以低扫描速率 (1.0 Hz) 在轻敲模式下成像，可以最大限度地减少尖端损坏。以接触模式测量解结合力，偏转设定点为 20 nm，回缩速度为 6 µm/sec。A 5 × 5 µm 2随机取样晶体表面上的区域，在大约 10 处测量 10 条力曲线。25个不同的地点。液体池经常用新鲜的 CaOx 溶液补充，每次液体注入后允许 15 分钟使激光偏转信号平衡。在不同的表面积上重复上述程序以生成超过 1200 条单独的力拉断曲线。将数据转换为力直方图，并使用正态分布计算平均力（标记为 F CaOx，用于修饰尖端与裸露 COM (100) 表面的相互作用）。

在聚电解质存在的情况下，通过将含有 5 µg/mL 聚合物的 0.11 mM CaOx 溶液注入样品池并允许 1.5 小时进行平衡来测量解结合力。AFM 测量使用相同的协议进行。在聚电解质（标记为 F添加剂）存在的情况下，改性尖端和 COM (100) 表面之间的解结合力是根据 1200 条或更多拉断曲线的平均值计算的。

2.4 COM-聚电解质聚集测定

COM 晶体聚集的评估如前所述[ 49 ]。0.25 mM CaOx 在 HEPES 缓冲液（HB：150 mM NaCl 和 10 mM HEPES，pH 7.5）中的亚稳态溶液与或不与聚电解质一起在 37°C 下孵育 15 分钟。将COM晶种加入缓冲溶液(HB中的1.5mg/mL晶种)并将浆液混合1小时。测量粒度（参见第 2.6 节）以评估在不存在和存在聚电解质的情况下的聚集水平。在对带相反电荷的聚电解质混合物的研究中，首先将聚阳离子添加到 COM 浆料中，然后添加聚阴离子，在分析之前允许孵育 1 小时。颗粒直径的相对变化 (R D ) 被用作颗粒聚集的评估，

2.5 聚电解质聚集测定

在单独的 96 孔板（总体积 = 0.2 mL）中制备聚阳离子和聚阴离子混合物的系列稀释液，其组成为 HB 中的 0.25 mM CaOx（即高盐）或 10 mM HEPES 中的 0.075 mM CaOx，pH 7.5（即低盐） . 基于使用 SPEC96 的计算，CaOx 浓度代表了两种不同盐浓度下的相对过饱和度的等效水平，SPEC96 是由 George Nancollas 开发的物种形成程序（经许可使用）。在室温下进行比浊法（λ630，PowerWave XS，Biotek）和粒度分析，在加入聚电解质后进行 15 分钟的平衡期。

2.6 粒度分布分析

使用 Accusizer 780 (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA) 表征添加和不添加聚电解质的 COM 晶体浆液。该仪器配备了一个 10-mL 进样针筒，每次分析以求和模式 (0.5–500 µm) 测量重复的 4-mL 样品。通过将 100–300 µL 等分试样添加到 15 mL 尺寸缓冲液（0.225 mM CaOx，HB）中，立即评估 COM 晶体聚集测定样品的粒径。

2.7 Zeta 电位测量

zeta 电位通过 NICOMP 380/ZLS (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA) 使用动态光散射法测定电泳迁移率进行测量。将样品置于配备铂电极的塑料比色皿中。在没有施加电场的情况下获取参考功率谱，然后在恒定电场下第二次获得样品光谱。内置软件用于计算多普勒频移（即参考光谱和样品光谱之间的频率变化）以获得电泳迁移率，(2)

其中 U 是电泳迁移率 (µm/sec), Δν 是多普勒频移, λ o是激光波长, n是溶液折射率, θ 是散射角, E是施加的电场 (V/cm ）。zeta 电位 (ζ) 由 Smoluchowski 方程计算：

通过将 750 µg COM 晶体浆液放入含有 3 mL 饱和草酸钙和 NaCl 的比色皿中，制备用于测量 zeta 电位的样品。将聚电解质添加到浆料中，1小时以吸附到晶体表面。在二元聚电解质混合物的研究中，首先添加聚阳离子并在添加聚阴离子之前平衡 1 小时（尽管我们观察到混合顺序对实验结果没有可检测的影响）。

3.0 结果与讨论

3.1 聚合物-聚合物相互作用

大多数蛋白质分子分散（即溶解）在尿液中，这是一种复杂的水溶液。一般来说，蛋白质在溶液中通过存在亲水性（特别是离子性）氨基酸和翻译后修饰来稳定。在溶液中，由于存在大量促进折叠（二级和三级）结构的疏水氨基酸，这些蛋白质可能比完全离子聚合物更紧凑。对结石形成很重要的聚合物-聚合物相互作用是长距离的（长度尺度与蛋白质的大小相称或更长）并且可以促进大分子（例如蛋白质）的聚集。虽然某些蛋白质能够形成离散大小的稳定聚集体（仅包含几个单独的蛋白质分子），聚集可以在更大的范围内发生，导致相分离。将几乎等量的高阴离子蛋白质与高阳离子蛋白质混合提供了这种行为的典型例子。[ 54 ]事实上，据报道这种混合物会引起 COM 晶体聚集，尽管当时没有发现聚合物聚集相的存在[ 49 ]。蛋白质诱导的 COM 聚集的一个例子是蛋白质 Tamm-Horsfall 蛋白质 THP，它是一种弱电解质，具有通过疏水力形成大聚集体的倾向。先前的研究表明，在晶体表面适度的 THP 聚集体吸附条件下，COM 晶间聚集得到促进[ 48 ]，从而为先前文献中相互矛盾的观察提供了背景。事实上，这些发现突出了聚合物-晶体相互作用对聚合物聚集行为的敏感性。

由于带相反电荷的聚电解质在医学、生物技术、光子学和催化等方面的应用，出现了许多与自组装相关的实验和理论研究[ 55 ]。关于聚合物逐层 (LbL) 组装[ 56 ]的大量工作已经发表，其中多组分结构是通过相互作用构建的，包括（但不限于）静电、氢键、共价键、疏水相互作用、杂交和/或生物识别[ 56 – 59 ]. 溶液中带相反电荷的聚合物的缔合导致相分离已被广泛研究为聚合物链长度以及溶液的 pH 值和离子强度的函数，包括远离生理相关性的条件[ 54 ]. 先前的研究表明，即使聚合物浓度非常低（< 0.1% 或 < 1µg/ mL）和中等盐浓度（0.05 至 0.5 M NaCl）。聚合物缩合通过类似于 Gower 等人描述的聚合物诱导液相 (PILP) 形成的过程耗尽了聚阳离子和聚阴离子的溶液[ 60 ]. PILP 工艺已在生物矿化系统中得到广泛研究。虽然即使在较低浓度下聚阴离子-聚阳离子配对也受到强烈青睐，但在这种条件下检测聚集体通常是有问题的。在高（非生理）盐浓度下，当小离子达到足以筛选驱动聚合物聚集的长程离子相互作用的浓度时，聚合物聚集体会重新分散（或重新溶解）。在两相区域，聚合物聚集相的微观液滴可以聚结，类似于油水混合物的行为。在低液滴浓度下，聚合物聚结可能需要几分钟或更长时间。预计随着聚合物或蛋白质链变长，分离相将更容易形成；当带相反电荷的链上的相反电荷的数量几乎相同时，聚集体的形成将最大化。在具有不等量的带相反电荷的蛋白质的混合物中仍会发生聚集（例如，据报道只有 10% 的次要成分）[ 54 ]。这些聚集体在非化学计量的聚阴离子-聚阳离子混合物中的存在引起了 COM 成核、聚集和生长速率的变化[ 61 ]。

聚电解质相行为的一个代表性例子在图 2对于 polyR 和 polyD 的混合物，这与下面讨论的蛋白质-晶体相互作用研究有关。聚合物聚集体的形成（第二相的存在）通过在较高聚合物浓度下含有几乎等量的 polyR 和 polyD 的混合物的浊度增加来检测。请注意，与以前的研究[ 54 ]相似，与低盐条件相比，在生理盐浓度下，两相区域扩展到更低的聚合物浓度。中的虚线图 2表示对应于 1:1 polyD-polyR 混合物的中性 +/- 电荷比（基于单体，假设完全电离）。虽然预计聚电解质聚集会发生在零电荷线附近，在该线周围产生对称的两相区域，但观察到的两相区域明显转移到富含聚阳离子的溶液中。从等电荷线观察到的位移的解释仍然不确定，尽管它可能反映了与聚阴离子相比聚阳离子的电离不完全或前者中的杂质含量更高。为此，使用离子色谱法通过测量反离子浓度（Na +用于 polyD 和 Cl -或 Br -聚R）。这些实验表明，基于添加的聚合物重量， Na +浓度约为 polyD 预期值的 95%，但 polyR 样品中 Cl- 或 Br- 的预期值仅为预期值的 80%；与观察到的富含聚阳离子的条件的偏移一致图 2.

图 2

polyR-polyD 混合物在低盐和 150 mM NaCl 下的相图。polyR 和 poly D 的分子量分别为 26 和 36 kDa。虚线表示具有相等数量的阴离子和阳离子（计算）的组成。浊点测定基于使用粒度仪作为检测器。在含有几乎等量的 polyR 和 polyD 的混合物中，在较高的聚合物浓度下观察到浊度增加，表明聚合物聚集体的形成；第二，浓缩的聚合物相，在这些稀溶液中。请注意，与未添加盐相比，在 150 mM NaCl 存在下，在较低的总聚合物浓度下观察到两相区域。

观察到的相行为可以基于静电力和周围电解质对聚合物链上电荷的筛选来解释。例如，聚阴离子链上的电荷位点相对于同一聚合物链上的其他阴离子位点会受到静电排斥力，这有利于链的拉伸以增加近端电荷之间的距离，从而减少静电排斥。同样，该链会排斥溶液中的其他阴离子链以保持分散。引入该环境的阳离子聚合物（或蛋白质）上的正电荷会与阴离子聚合物产生静电吸引力，从而导致离子配对相互作用，从而同时降低聚阴离子上阴离子部分之间的净排斥力。[ 54 ]添加的盐屏蔽静电相互作用，减少聚合物内/聚合物间的吸引力和排斥性相互作用，尽管在生理盐浓度下长程相互作用仍然足够强，以允许聚合物聚集体形成和相分离。在盐浓度为 1M 或更高时，电解质会屏蔽除极短程电荷相互作用外的所有电荷相互作用，从而消除因长程相互作用而产生的带相反电荷的聚合物之间的吸引力放大，从而导致聚合物聚集体重新溶解。这些条件超出了正常尿液生理学的范围，但静电筛选的一般概念对于理解弱电荷聚电解质（如 THP）的溶液行为很重要。

由于带电基团的存在，聚电解质在水溶液中稳定。例如，尿蛋白（即带弱电的聚电解质）主要是阴离子的。许多蛋白质的球状或三级结构（即链折叠基序）是熵驱动力的结果（特别是疏水性氨基酸从与水的接触中去除以最小化自由能）。溶解盐的存在通常会降低尿蛋白的溶解度，因为较弱的远程静电排斥力更容易被压倒。这些蛋白质的聚结（聚集）受疏水相互作用和范德华力的支配，但蛋白质聚集引起的电荷积累可能达到一个临界极限，阻止进一步添加超出有限大小的蛋白质。[ 48 ]在 150 mM NaCl（生理盐水）中，其中有限大小的稳定聚集体的形成与 THP 浓度无关。相反，相同的蛋白质在低盐浓度下保持分子分散（溶解）。对于天然 THP，观察到相同的行为，但盐浓度要高得多。值得注意的是，天然 THP 保持分子分散在 150 mM NaCl 中，但通过在 ca 处聚集而与溶液（和其他溶解的蛋白质）相分离。0.5 M 氯化钠。如下所述，天然或脱唾液酸 THP 的聚集体诱导 COM 晶体聚集，而它们的分子分散形式阻止了晶体聚集。对 THP 的许多不一致结果中的实验条件进行仔细审查[ 32 , 62– 67 ]表明 THP 聚集体的存在与否可能是这些实验结果中无法识别的变量。

由于 THP 在水中的有限溶解度和聚集相的两亲性质以适应典型蛋白质中的离子和疏水部分，因此在尿液环境中观察到的 THP 蛋白质聚集体形成似乎可以推广到其他蛋白质。最直接的例子在图 3，其中 1 维十二烷基硫酸钠 (SDS) 聚丙烯酰胺凝胶电泳数据描绘了泳道 2 中的正常尿液大分子、残留在上清液中的大分子（泳道 3）和包含在通过向尿液中添加 polyR 形成的蛋白质聚集体中的大分子（车道 4)。为 THP 和另外两种常见的尿蛋白，人血清白蛋白 (HSA) 和骨桥蛋白 (OPN) 指明了洗脱位置。显然，大多数尿蛋白都包含在聚集相中，尽管只有 OPN 可以被合理地描述为一种强聚阴离子，它会主导与 polyR 的相互作用。对于带弱电的聚电解质（例如，THP），这种趋势在 Far Western 印迹中得到了例证，在 SDS-PAGE 凝胶上，去唾液酸化的 THP 对大多数尿蛋白表现出很强的亲和力。然而，

图 3

银染 SDS-PAGE 分析揭示了正常尿液大分子的条带（泳道 2）、通过向尿蛋白混合物中添加 polyR 诱导的蛋白质聚集体（泳道 4）以及用 polyR 分离蛋白质聚集体后保留在溶液中的蛋白质部分（车道 3）。大多数蛋白质出现在聚集相中，其中许多蛋白质在聚集相和上清液中都存在，少数蛋白质在上清液中富集。分子量标记显示在泳道 1 中。

3.2 蛋白质-晶体相互作用

分子量效应

蛋白质的聚合性质是蛋白质与 CaOx 晶体表面相互作用的重要考虑因素，因为聚电解质中离子侧链的数量强烈影响它们与晶体表面的相互作用，进而影响它们作为晶体生长抑制剂的功效。我们使用一系列分子量的 polyD 探索了 CaOx 晶体生长速率抑制的分子量依赖性，它经常用作阴离子尿蛋白（如 OPN）的模型聚合物。如图所示图 4，当将含有 60 个氨基酸残基的蛋白质与独立作用的氨基酸单体进行比较时，实现对结晶过程的等效抑制所需的 polyD 浓度降低了约 10,000 倍。在比较 COM 晶种的聚集抑制时观察到类似的行为（图 4, 钻石) 或直接结晶到 COD 而不是热力学更稳定的 COM 相的能力 (图 4, 圆圈), 两者都与显着的 COM 生长速率抑制相关 (>90%) [ 61 , 68 ]。

图 4

聚合物分子量对抑制 COM 聚集或 COD 形成的影响在此聚合物浓度 (conc) 与polyD聚合度 ( n , 链长) 的对数图中说明。菱形显示在聚集测定中达到 R D = 0.9所需的每个分子量的聚 D 浓度。圆圈显示实现 50% COD 形成所需的每个分子量的 polyD 浓度，作为 COM 生长速率抑制的量度。

在 CaOx 生长抑制中 polyD 和 polyAA 的临界分子量可以定义为在测试一系列分子量时需要聚阴离子的最小质量浓度（单体单元的数量）以达到相同的抑制水平的分子量。如图所示图 5，在对各种分子量的 polyAA（正方形）和 polyD（菱形）进行自发成核试验中获得 50% COD 所需的聚合物浓度揭示了每种聚合物的临界分子量（polyAA 约为 5 kDa，polyD 约为 15 kDa） . 值得注意的是，polyAA 似乎是更有效的 CaOx 结晶抑制剂，因为需要更少量和更短的链才能达到相同的抑制水平。观察到 polyAA 抑制 CaCO 3形成的类似特征，已对其防止水管中的 CaCO 3结垢进行了检查[ 69 ]. 这些研，足够大的聚合物，可以有效地阻挡整个生长部位。更大的聚合物没有提供比临界尺寸聚合物更大的益处，因为至少一个链必须结合以阻断生长位点，并且超出阻断活性生长位点所需量的额外单体会增加质量浓度而不增加抑制性能。

图 5

在自发成核实验中诱导 COD 形成所需的聚合物浓度与分子量的关系。菱形显示 polyD 分子量系列的数据。正方形显示聚AA 分子量系列的数据。最小质量浓度记录在 ca。polyAA 和 ca 为 5 kDa。polyD 为 15 kDa，表明这些分子量的抑制剂效果最大。

聚合物化学结构效应

定义 CaOx 晶体的晶面是检查 CaOx 晶体相互作用的重要第一步，因为表面离子的排列和取向在 COM 和 COD 晶体的不同面之间不同（图 6）。例如，我们已经观察到不同晶面的优选聚合物相互作用[ 30 ]。在先前的化学力显微镜 (CFM) 研究中，我们测量了具有特定 CaOx 晶体表面的化学功能化原子力显微镜 (AFM) 尖端的解结合力。镀金 AFM 尖端分别用 11-巯基十一烷酸或巯基乙基胍修饰以模拟天冬氨酸/谷氨酸（羧酸，-COO -）或精氨酸（脒，-C(NH 2 ) 2 +）侧链。COM（100）面（大六边形表面）表现出最强的脱附力，而 COD（101）面（大三角形表面）表现出最弱的脱附力[30 ]。解结合力与每个面的表面离子（Ca +2或 Ox -2）密度相关，COM 晶体在结石中比 COD 更常见的临床观察[ 44 , 70 , 71 ]与以下事实一致：COM 晶体上最大的面最有粘性，而 COD 上最大的面对常见的蛋白质官能团的粘性最小[ 72 ]。

图 6

COM（上）和 COD（下）晶体主要面的米勒指数在相邻显微照片的示意图中显示，以及它们的空间群和晶胞尺寸。

类似地，可以通过比较阴离子聚合物或尿蛋白对 CaOx 晶体表面的影响来观察它们对 CFM 测量每个表面的非结合力的影响。如图所示图 7[ 73 ]，三种阴离子聚电解质通常会降低 COM 晶体三个主表面中每一个的羧酸官能化尖端的解结合力（除了聚 E 对 (100) 面的解结合力的影响可以忽略不计）。这些数据表明，聚阴离子通常与 COM 面强烈结合，干扰尖端晶体结合，尽管 polyE 与 (100) 表面的较弱相互作用表明这种相互作用具有一定的化学特异性。同样，使用脒修饰尖端的 CFM 测量产生了类似的结果（参见图 8)，尽管在这种情况下，与 polyD 和 polyE 相比，polyAA 在降低 COM (100) 处的解结合力方面表现出降低的效果。

图 7

在 150 mM NaCl 溶液中羧酸功能化 AFM 尖端和各种 COM 晶面之间的解结合力的化学力显微镜测量。在 5 µg/mL 的多肽浓度下，使用和不使用各种多肽添加剂进行测量。（经参考文献73许可转载）

图 8

在含有各种聚电解质的溶液中使用脒和羧酸官能化 AFM 尖端在 COM (100) 表面测量相对解结合力。相对解结合力计算为在聚电解质 F添加剂存在下测得的力与在没有添加剂 F CaOx的情况下在裸 COM (100) 表面上测得的力之比

在聚合物添加剂存在下生长的 COM 表面的原位AFM 测量揭示了三个突出的 COM 表面的各向异性生长速率的明显差异：(100)、(010) 和 (12-1) 面[ 50 ]。值得注意的是，polyE 减少了沿 [010] 方向的生长（即类似于尿蛋白的影响，例如 OPN [ 74 , 75 ]），而 polyD 和 polyAA 抑制了沿 [100] 方向的 COM 生长。PolyAA 是两个面上所有测量方向上最有效的分层生长抑制剂。PolyE 在 (100) 面上表现出较弱的生长抑制，但在 (010) 面上比 polyD 更有效，这与 CFM 测量结果一致。50 ]。

分子水平上化学官能团与晶体表面相互作用的差异与报告的体结晶特性差异相关，例如自发成核 CaOx 晶体的相和形态。虽然 polyD 和 polyAA 促进 COD 结晶，但 polyE 在较高（生理相关）浓度下诱导 COM 的哑铃聚集体。[ 50 , 68 ]带有羧酸残基的聚阴离子强烈抑制 COM 生长，抑制效果按 polyAA > polyD > polyE 的顺序降低[ 61 ]. 虽然这些聚合物在防止 COM 晶种在接近平衡条件下聚集方面表现出大致相同的效果，所有这些都促进了分解[ 49 , 61 ]，但它们在过饱和介质中的效果不同。PolyD 阻止了在恒定成分生长试验中通常在过饱和（生长）条件下观察到的 COM 聚集，这被定义为与生长相关的聚集，而 polyE 促进了这一过程[ 61 ]. PolyAA 未在该系统中进行测试，因为它会干扰钙敏感电极在恒定成分测定中的功能。总之，这些观察表明聚阴离子通常与 COM 结合并抑制生长和聚集过程，但 polyD、polyE 和 polyAA 侧基之间化学结构的微小差异与面选择性和本体结晶过程的差异有关。这些差异在本文所述的聚电解质混合物研究中具有重要的影响。

诚然，与模型聚电解质相比，天然蛋白质的结构更复杂，因为前者包含许多不同的氨基酸（例如，D 和 E 残基的组合）、额外的阴离子位点（例如，磷酸化和糖基化），以及更复杂的二级/三级结构. 虽然对天然阴离子尿蛋白的实验倾向于支持聚阴离子对 COM 结晶过程的抑制作用[ 76 ]，但已经报道了一些意料之外的结果。例如，在存在 OPN 的情况下，在 (100) 表面测得的解结合力大于对照[ 52 ]，但 (010) 表面上的优先结合与生长小丘形成的动力学抑制有关[77 ]。由于 OPN 主要包含 D 残基（25% 与 15% E 残基相比），因此可以预期 OPN 结合会降低 (100) 表面的解结合力。同样，它对 (010) 表面的结合偏好令人惊讶。几项体内研究已将 OPN 与促进结石形成联系起来，主要是通过其同时结合 CaOx 晶体和细胞表面的能力[ 45 ]. 显然，其他化学结构细节必须在天然蛋白质与 COM 晶体和石头的相互作用中发挥作用。其他天然蛋白质，如血清白蛋白和 THP，与 CaOx 晶体的相互作用要弱得多，但只要它们作为分子分散的物质留在溶液中，它们仍然会抑制晶体生长和聚集。相反，蛋白质可以作为晶体生长促进剂。最近的一份报告[ 17 ]描述了从石基质中提取并通过离子交换色谱和分子筛纯化的蛋白质促进 COM 生长，尽管 SDS-PAGE 分析表明其中一些分离物含有一种以上的蛋白质。Farmanesh 等人的另一份报告。描述了两种蛋白质（溶菌酶和乳铁蛋白）以及含有阴离子和阳离子残基的溶菌酶肽片段的类似生长促进作用[ 51 ]。

还必须考虑非离子氨基酸的作用。事实上，大多数蛋白质结构都以非离子氨基酸为主，它们通常对结晶没有明显影响。检查天然蛋白质结构片段的实验表明，通过增加片段中阴离子侧链的数量来增强抑制特性，通常是通过调整翻译后修饰，如磷酸化[ 78-81 ]。对于含有不同数量/序列的天冬氨酸残基的模型肽，已经报道了类似的工作，随着酸含量的增加对 COM 生长的抑制作用增强[ 82 ]. 除了稀释强相互作用的阴离子基团的影响或带电基团沿一级序列的空间分离之外，非离子氨基酸显然对蛋白质-晶体相互作用几乎没有影响，尽管一份出版物显示了氢键，非离子氨基酸与其他非离子氨基酸相比，丝氨酸可以增强表面相互作用[ 83 ]。此外，基于方解石（碳酸钙）中的数据，已经建议晶体表面的疏水相互作用在加速生长中发挥重要作用[ 84 ]. 虽然对数百种尿蛋白混合物的复杂性进行建模超出了我们目前对蛋白质-晶体相互作用的理解水平，但大量研究表明，来自正常个体的蛋白质混合物会抑制 COM 晶体的生长和聚集，这与净阴离子特征一致蛋白质混合物[ 85 ]。在我们的实验中，使用 polyD 作为仿生聚阴离子可以最好地模拟各种体积结晶研究中尿蛋白混合物的行为。

先前的研究表明，聚阳离子，例如 polyR 和 polyK，在体积测量中是 COM 晶体生长的无效抑制剂。这有点令人惊讶，因为 CFM 测量显示脒鎓和羧酸功能化 AFM 尖端与 CaOx 晶体表面的粘合相互作用强度相似[ 52 ]。在接近平衡的条件下，与聚阴离子相比，这些聚阳离子较弱地分解 COM 晶种，它们对生长、聚集或相选择性的影响很小或没有影响[ 61 ]，尽管在附近存在阳离子残基的蛋白质和肽的促进作用较弱。已报道阴离子残留物[ 51 ]. 此外，在自发成核实验中没有观察到这些阳离子聚合物对 COM 形态的明显影响。有趣的是，溶液中 polyR 的存在不影响 COM（100）表面的羧酸功能化尖端的解结合力（参见图 7)，表明聚阳离子和 COM 表面之间的相互作用比羧酸基团表现出的相互作用弱。这些观察结果与使用脒官能化尖端进行的 CFM 测量一致（图 8)，其中聚阴离子降低了解结合力，而聚阳离子没有效果。在取决于聚合物侧基的化学结构的解结合力测量中观察到差异。值得注意的是，polyD 和 polyE 在解结合力方面表现出相似的降低，而 polyAA 对脒官能化尖端的影响不太明显。相比之下，羧酸功能化的尖端数据显示 polyAA 和 polyD 在降低非结合力方面同样有效，而 polyE 无效。

聚电解质存在下的 Zeta 电位 (ζ) 测量 (表格1) 揭示了这些“模型蛋白”与 COM 表面结合并影响表面电荷。在不存在聚电解质（对照样品）的情况下，COM 晶体在低盐（0.15 mM CaCl 2和 Na 2 Ox）和高盐（0.2 mM CaCl 2和 Na 2Ox 与 150 mM NaCl) 缓冲液。在 5 µg/mL 浓度的聚阴离子存在下，COM 晶体保持负电荷，但 ζ 的大小随着 poly AA > poly D > control > poly E 而减小，这与酸基团电荷密度降低的趋势相似每个聚电解质中的每个单体。高盐条件（模拟生理盐水）似乎使每个聚阴离子的表面负性更强，尽管电荷差异接近观察到的 ±2 mV 测量误差。相反，浓度为 5 µg/mL 的聚阳离子 polyR 和 polyK 将净电荷转变为正电荷，具有相似的量级，并且对添加的盐浓度几乎没有依赖性。显然，

表格1

COM 晶体在均聚物溶液中的 Zeta 电位。

聚电解质

ζ (mV) 低盐

ζ (mV) 高盐

总的来说，我们的观察表明聚阴离子 (i) 在 COM 表面表现出非常强的结合相互作用，(ii) 将有效表面电荷修改为取决于单个吸附物的值，以及 (iii) 通常在结晶的各个方面作为抑制剂起作用。聚阴离子晶体相互作用的差异，特别是 polyD 和 polyE 之间的差异，表明对吸附物的化学结构敏感的细微差别。另一方面，聚阳离子与 COM 表面的相互作用较弱，对结晶的影响要小得多，尽管它们与 COM 结合到足以改变表面电荷的水平。经典胶体化学认为，聚阳离子与带负电的颗粒（例如 COM 晶体）在悬浮液中的混合物应诱导聚集[ 86 ]. 由于晶体聚集体是结石形成的重要组成部分，因此更仔细地研究了表面电荷与聚集体之间的联系。

polyR 对 COM 表面电荷影响的系统研究表明，随着 polyR 浓度的增加，ζ 增加，并且在约 1.43 ng polyR/µg COM 时实现了有效的 COM 电荷中和（ζ = 0 mV）。图 9A）。随着 COM 表面上的聚阳离子覆盖率进一步增加，ζ 继续快速上升到 ζ = +13 mV 的表观饱和值（见表格1）。在 ζ = 0 mV 区域仔细探索了作为 polyR 浓度函数的散装 COM 聚集行为。在 ζ = 0 mV 时表面电荷稳定性的丧失应该允许结合到晶体表面的聚合物链桥接相邻的颗粒，从而形成具有接近中性表面电荷的凝胶或聚集体，但这些聚集体应该在较低或较高的聚合物浓度下消散带电粒子会相互静电排斥并稳定溶液中的粒子悬浮液。然而，在 polyR 和 COM 晶体的混合物中没有观察到聚集（图 9B）。显然，聚阳离子以足够的强度与 COM 表面结合以随晶体迁移（在所谓的围绕晶体表面的双层内）并将有效表面电荷从负电荷变为正电荷。然而，聚阳离子的这种结合不足以形成桥接相互作用或保护表面免受向晶格中添加更多钙和草酸盐离子或其他大分子（或化学修饰的 AFM 尖端）的粘附相互作用。相反，聚阴离子显然与 COM 强烈结合并形成桥接相互作用，但它们明显抑制聚集。后一种结果可能仅仅是 COM 粒子电荷稳定的结果，但桥接相互作用也可能受到与晶体尺寸 (µm) 相比相对较短的聚合物链长 (nm) 的限制，[ 87 - 92 ]。

图 9

(A) COM 晶体在 150 mM NaCl 中的 Zeta 电位作为 polyR 与 COM 晶体质量比的函数，表示为 (ng polyR/µg COM)。近似 S 型依赖性显示从 1ng/µg 的无影响 (ζ= -14 mV) 到 2 ng/µg 的接近饱和极限 (ζ= 12mV) 的急剧转变。(B) 来自聚合测定的 R D作为 polyR 与 COM 晶体质量比的函数。在零表面电荷区域中测试了多个样品，发现没有证据表明添加聚阳离子 polyR 会诱导 COM 晶体聚集。虚线表示 R D对照（未添加 polyR）实验的值。观察到的与对照的偏差在此测量的不确定性范围内，表明电荷中和不足以触发 COM 粒子聚集。

蛋白质聚集的影响

THP 的研究提供了蛋白质聚集体-COM 晶体相互作用的清晰画面，因为 THP 聚集体颗粒在比典型实验更长的时间尺度（例如，几个小时）内保持稳定的尺寸。使用 THP 聚集体与 COM 晶体质量的不同比率获得的数据产生了 COM 聚集体形成的变化，可以通过简单的吸附模型来描述。这些计算表明，COM 聚集在蛋白质聚集体的低表面覆盖率（约 30%）下最大化，因此结合到一个晶体表面的蛋白质聚集体可以找到并结合到相邻晶体上的暴露表面，形成一个桥，如图所示图 10. 在较高的表面覆盖率下，相对晶体表面上吸附的 THP 聚集体的存在会阻碍晶体聚集，因为蛋白质聚集体不容易相互粘连[ 48 ]. 天然 THP 分子也可以在较高盐浓度（天然蛋白质形成聚集体）下诱导 COM 聚集这一事实证实了蛋白质-蛋白质相互作用在 COM 聚集中的关键作用。没有在生长条件下用脱唾液酸化的 THP 进行类似的研究，尽管我们预计，与相同浓度的分子分散蛋白质相比，THP 聚集体对生长过程的抑制效果较差，因为游离蛋白质颗粒的数量减少了。解决方案。大多数尿液蛋白的相行为的相似性是通过在远西方印迹中去唾液酸化的 THP 和其他尿液蛋白之间的强相互作用暗示的[ 48 ]. 许多早期研究没有考虑 THP 聚集体形成的可能性，这并不奇怪地显示出 THP 晶体相互作用的不同行为，正如该主题的先前评论中所总结的那样[ 1 , 39 , 93 ]。

图 10

图示说明了提议的去唾液酸化 THP-COM 聚合的覆盖依赖性。出于说明目的，COM“种子”表面被描述为单晶，具有 COM 晶体的特征拉长六边形形态（参见图 6）。吸附很可能发生在 (100) 表面上，该表面占单晶的最大表面积，并且可能是 COM 晶种的主要表面积。这里说明了两种情况，用于在 (A) 部分覆盖 (50%) 和 (B) 完全覆盖 (100%) 时将聚集体吸附到 COM。前者通过晶体 - 蛋白质 - 晶体桥接相互作用促进 COM 聚集，而在某些阈值覆盖率（此处显示为完全被聚集体覆盖的表面）时，相对晶体表面上的蛋白质聚集体之间的排斥抵消了由任何剩余的晶体 - 蛋白质 - 引起的有吸引力的相互作用水晶桥。（经参考文献47许可转载）

虽然我们最初使用 polyD 和 polyR [ 49 ]的近等摩尔混合物报告了 COM 聚集，但随后的实验描述了在更广泛的混合比、聚离子组成和聚离子浓度范围内的相行为（图 11）。在接近等摩尔浓度的带相反电荷的聚电解质中，在 polyR-polyD 混合物存在下 COM 晶体的相对粒径 (R D ) 随着聚合物浓度的增加而增加，在聚合物相界附近达到统计显着性，由阴影区域表示在图 11A. 每种聚电解质组分的数据分别显示这些聚离子在不存在带相反电荷的聚合物的情况下引起解聚（即 R D < 1.1）。这种现象对于 polyD 更为明显，在低 polyD 浓度下观察到的 R D显着降低，随着 polyD 浓度的增加（测试高达 12 μg/mL）达到 0.8（在 1.5 µg/mL 时）的极限值。在含有 polyR 的溶液中，R D在低浓度时与对照无法区分，并且在 polyR 浓度高于 2 µg/mL 时达到 0.9 的极限值。

图 11

在不同聚合物浓度和电荷比下，含有 polyR 和 polyD 的溶液中的 COM 聚集。(A) 在 polyR (26 kDa) 和 polyD (36 kDa) 的二元和均聚物溶液中 COM 种子的相对直径随聚合物浓度的变化而变化。混合聚合物的浓度是指 polyR 浓度，其中添加 polyD 以保持 1:1 的单体比例。(B) 左轴：COM 晶体与 polyR(+)/polyD(-) 混合物在组成为 0.25 mM CaO x的溶液中的相对直径 (R D , Eq. 1 ):150 mM NaCl:10 mM HEPES，pH 7.5。将不同数量的 polyR (15 – 270 nM) 添加到含有 49 nM polyD 的种子 COM 溶液中。右轴：COM 聚电解质颗粒的 zeta 电位。实线是插值，R D = 1.1处的水平虚线是指在没有聚电解质的情况下获得的对照测量值。

COM 聚集的诱导显然取决于导致相分离的带相反电荷的聚合物的聚集，因为两种聚合物都不会单独产生这种影响。THP 聚集体的实验表明，COM 聚集的程度取决于蛋白质聚集体表面积与 COM 表面积的比率。由于 polyR-polyD 聚集体最初形成为非常小的颗粒（亚微米尺寸），逐渐聚结形成离散相，因此聚合物聚集体与 COM 晶体表面积的比率随反应时间而变化。因此，晶体聚集的程度受到这种聚结过程的时间性质的影响，这是一种尚未完全表征的动力学成分。定量复制这些结果将取决于精确匹配的混合条件，

R D随 polyR 和 polyD 比例的变化如图所示图 11B. 用恒定的 polyD 浓度和不同量的 polyR 制备溶液，以实现从 0.5（富含聚阴离子）到 3.0（富含聚阳离子）的电荷比。最大 COM 聚集体尺寸 (R D = 2.2) 出现在 COM 电荷中性附近 (polyR/polyD = 1.0)，尽管它略微转移到富含聚阳离子的条件下（即表面正电荷）。这些观察结果与其他带相反电荷的聚电解质的观察结果类似，例如 DNA-聚阳离子聚电解质间复合物 (IPEC)，它们在等摩尔组成下表现出更高的聚集体形成速率[ 94 ]. 令人惊讶的是，这些混合物中 COM 晶体的 ζ 转变遵循预期的从负电荷到正电荷的 S 形转变，在富含聚阴离子的条件下跨越 0 mV，因此 COM 聚集显然不是由表面电荷稳定性的丧失介导的。在聚离子电荷比高于或低于最大值时，R D迅速下降到控制值（R D = 1.1），尽管我们注意到任何一种聚合物独立作用都会导致 R D低于控制值。因此，即使在聚阴离子或聚阳离子过剩的情况下，polyR-polyD 聚集体似乎也会诱导晶体聚集。

使用其他方便获得的聚阴离子和聚阳离子探索了聚阴离子/聚阳离子混合物对 COM 表面电荷和聚集的影响。COM 晶体的 zeta 电位是在含有不同比例的聚阳离子和聚阴离子对的溶液中测量的（图 12）。这些二元混合物都表现出相似的趋势，其中 ζ 的范围从富含聚阴离子的溶液中的约 -10 mV 到富含聚阳离子的溶液中的 +10 mV。COM 电荷中和发生在 0.7 和 0.9 之间的聚电解质电荷比，这表明对于所有这些组合，在富含聚阴离子的混合物中发生净零电荷。使用这些聚阳离子-聚阴离子混合物中的每一种在两相区域内的等摩尔条件下进行 COM 聚集测定。结果显示在表 2揭示了聚阳离子的选择对COM聚集促进的影响很小，而聚阴离子的选择有显着的影响。当 polyD 或 polyAA 与 polyK 或 polyR 结合时，观察到促进 COM 聚集，而所有含有 polyE 的混合物都会导致 COM 解聚（R D< 1.1)。在 CFM 研究中观察到的 (100) 表面缺乏 polyE 相互作用可能与该结果相关。(100) 面通常是 COM 上最大的面，晶体之间的桥接相互作用必须包括聚合物与每个晶体的结合；似乎是由聚阴离子组分驱动的过程。因此，与 (100) 不牢固结合的 polyE 不能成为聚集所需的桥接相互作用的一部分，即使 polyE 会与聚阳离子形成聚合物聚集体。相反，polyAA 和 polyD 在诱导 COM 聚集方面同样有效，并且都表现出在 (100) 表面的强相互作用，以及阻碍向晶体中添加 CaOx 生长单元（生长抑制）。

图 12

COM 晶体在含有聚电解质混合物的溶液中的 Zeta 电位。聚阳离子（polyR、polyK）和聚阴离子（polyAA、polyD、polyE）以不同的电荷比组合。在没有聚电解质（虚线；对照）的情况下，COM 表面的 zeta 电位为 -14 mV。COM-聚电解质复合物的零电荷点出现在聚阳离子与聚阴离子电解质的电荷比低于 1 时，这表明聚阴离子的存在增强了聚阳离子在 COM 晶体表面的吸附。

表 2 COM 聚集在带相反电荷的聚电解质的 1:1 混合物中。

聚合物混合物†

RD=D吨Dt = 0

阳离子

阴离子

† 0.25 mM CaOx：150 mM NaCl：10 mM HEPES，pH 7

在这些混合聚电解质的研究中，富聚阳离子溶液中 COM 晶体的正 ζ 值似乎高于单独使用任一聚阳离子观察到的值，这表明与聚阴离子的协同作用促进了聚阳离子与 COM 表面的缔合。CFM 测量是在含有不同比例 polyD 和 polyR 的溶液中进行的，总聚电解质浓度为 5 µg/mL (图 13)，以更好地表征这种效果。CFM 测量中的解结合力是在含有 1:2、1:1 和 2:1 质量比的聚阳离子和聚阴离子混合物的溶液中获得的，对应于 33、50 和 67 wt% 的 polyR。将结果与 polyD 和 polyR 的均聚物溶液（分别为 0 和 100 wt% polyR；另见图 8）。随着 polyD 含量的降低，羧酸改性的 AFM 尖端的解结合力单调增加，这表明增加 polyR 分数有效地降低了 polyD 的表面覆盖率。在 polyR/polyD 混合物存在的情况下，脒修饰的 AFM 尖端与 COM (100) 表面的结合似乎比在 polyD 单独存在的情况下更弱；然而，在单独存在 polyR 的情况下，解结合力与未修饰的 COM 表面没有什么不同。这种模式表明 polyD 促进了 polyR 在晶体表面或晶体表面附近的结合，可能是通过 polyD 表面相互作用，这样它就可以干扰脒修饰尖端的结合。一旦 polyD 被去除（即 100% polyR 溶液），

图 13

在含有各种 polyR 和 polyD 混合物的溶液中，用脒鎓 (-C(NH 2 ) + ) 和羧酸 (-COO - ) 部分修饰的 AFM 尖端与COM (100) 表面之间的相对分离力。在每个实验中，在总聚电解质浓度为 5 µg/mL (polyR + polyD) 的 0.11 mM CaOx 溶液中进行测量。

类似系列混合物的本体溶液测量数据先前已发表[ 61 ]并表明在 COM 晶体聚集促进方面，富含 polyD 的混合物与对照（未添加聚电解质）几乎相同。然而，这个结果仍然与观察到解聚的 polyD 完全不同。另一方面，该混合物和单独的 polyD 之间的 COM 生长速率抑制测量值相似，表明存在的聚合物聚集体在晶体聚集过程中比在生长中更强烈地参与。另一方面，等摩尔（电荷中性）和富含 polyR 的混合物明显阻止了与生长相关的聚集，并将主要的生长机制转变为恒定组成实验中的二次成核[ 61 ]，以及促进 COM 晶种在饱和 CaOx 溶液中的聚集[ 49 ]。与对照相比，富含聚 R 的条件似乎也增加了晶体生长速率，这可能类似于通过含有阴离子和阳离子侧链的选定天然蛋白质结构加速生长的报道。

4.0 结论

总之，聚阴离子（例如，polyD、polyAA 和 poly E）、天然尿蛋白（例如，THP 和 OPN）以及从正常尿液中分离的大分子混合物，与晶体表面紧密结合，通常抑制 COM 成核、生长、和聚合。非结合力的 CFM 测量表明，聚阴离子可以阻止用脒（阳离子）和羧酸（阴离子）末端基团化学修饰的 AFM 尖端的粘附，这表明这些吸附的聚合物掩盖了晶体表面。界面和块状晶体分析揭示了聚电解质-COM 相互作用的明显差异，这是由于聚阴离子化学结构（polyD 与 polyE）的差异强烈影响了选定 COM 面的相互作用，但也表现为可观察到的块状结晶差异，特别是在聚合行为中。相反，聚阳离子被吸引到 COM 晶体表面，可能是通过不足以导致强结合的静电吸引力，因此对本体结晶过程或 CFM 解结合力测量几乎没有影响。当聚阳离子与聚阴离子结合时，形成的聚阳离子-聚阴离子聚集体可以与聚阴离子-晶体相互作用竞争，在某些情况下会促进晶体聚集，而在其他情况下会促进成核和生长。聚合物聚集体的效果在很大程度上取决于聚阴离子组分的结合特性，例如由 polyD 与 polyE 形成的聚合物聚集体之间的 COM 聚集行为的差异。

为本研究选择的模型聚电解质包含模拟人肾结石有机基质中尿液成分部分的官能团，结晶测定中有限的实验数据已证明与天然蛋白质相似的行为。尿液大分子的混合物可能过于复杂，无法用单一模型聚电解质来近似；然而，鉴于所有蛋白质都含有相同的氨基酸，因此具有不同比例的相同离子侧链，这种混合物的复杂性与单个成分的主导作用相矛盾。此处报告或讨论的实验说明了一系列行为，这些行为表明基于将混合物的平均特性视为关键参数的结石形成途径。尤其，这些实验说明了聚合物聚集体可能在 CaOx 晶体生长抑制和促进晶体聚集中发挥的重要作用，这似乎不依赖于独特的蛋白质确认（二级或三级结构）。显然需要进行更详细的研究来开发聚电解质与 COM 表面结合的分子水平知识；然而，蛋白质聚集的特征，可能同时涉及许多不同的蛋白质，应该在尿蛋白和结石基质的研究中寻找，并可能进一步深入了解控制结石形成的关键过程。