膜蛋白抗体开发策略：基于过表达细胞系的全人源抗体库筛选技术

摘要

抗体药物是近二十年以来生物医药领域主要方向之一，成功发现新抗体的关键是抗体筛选过程中所采用的靶点蛋白必须能正确反映其天然空间构象。但目前在研靶点中，大部分蛋白为单次或者多次跨膜蛋白，有的具有由多个结构域组成的扩展胞外区域，给抗体筛选带来了巨大挑战。

解决这个问题的一个可行方案是使用整个细胞作为抗原来进行抗体文库筛选，从而保持蛋白质的天然构象以及避免抗体识别不必要的表位。

噬菌体展示技术在抗体筛选中的应用

在生产单克隆抗体（mAb）的过程中，杂交瘤技术曾是较为常用的技术，但杂交瘤技术存在一些难以克服的缺陷，例如：

1必须对小鼠周期性免疫，有些蛋白（毒性蛋白、组蛋白）难以获得理想的免疫效果

2生成的抗体需要进行人源化改造，工作费时费力；

而噬菌体展示全人源抗体技术则为此提供了一种高效解决方案，该技术优势主要在于：

1筛选流程简便，周期短，且不依赖于活体的免疫系统

2能够直接获得全人源抗体，避免了复杂的人源化工作

图1  噬菌体抗体库筛选流程

该技术最早由George·Smith发明，基本原理是将多肽或蛋白质的基因与丝状噬菌体P3蛋白融合表达，在辅助噬菌体的参与下，展示在噬菌体颗粒表面。将蛋白分子的基因型与表型完美的结合在了一起。这样构建出的抗体库经过2~3轮迭代筛选即可获得大量特异性结合抗原的抗体基因序列。

基于过表达细胞系的全人源抗体库筛选

不同筛选体系中的抗原固定方式

图2 不同筛选体系中表位暴露示意图

在对肿瘤抗原和受体等膜蛋白的筛选中,保持其天然构象至关重要。这些肿瘤相关抗原和受体蛋白一样,多具有膜蛋白结构特征,或是可以形成复杂的结构。

常规的固相筛选中使用的是胞外区的重组抗原，而重组的抗原无法完全还原细胞膜上抗原的天然构象，且包被的抗原不一定能将胞外区抗原表位正确的暴露出来，因而不适合用于膜抗原表位的抗体筛选。

而用过表达抗原的完整细胞进行筛选(cell-based antibody selection)可以避免构象改变引起的筛选效率低下的问题。

 细胞筛选的技术难点及改善方法

（1）技术难点

在细胞（或组织）上选择噬菌体展示基因文库的主要挑战是细胞表面包含大量的受体和蛋白质。不同于对固定化抗原的筛选，细胞表面蛋白数量众多,某些蛋白组分丰度较高,容易对过表达抗原的细胞筛选造成干扰，甚至难以分离出目的抗体。

（2）改善方法

图3 细胞筛选流程图（仁域生物供图）

提高细胞筛选效率的方法主要从两个方面入手：其一是降低背景信号的干扰；其二是提高选择的灵敏度和特异性。降低背景最直接的方法就是用相应的阴性细胞系（negative cell line）或组织进行背景扣除,这是一个负选择的过程。

其中影响背景消减效果的因素主要有:用于背景扣除的细胞系的选择和细胞数量、细胞/噬菌体的比率、结合和洗涤的条件、噬菌体和细胞的分离方法以及选择的轮数。在实际操作中如何设置正、负选择取决于所用抗体库的类型和库容量、细胞或组织类型、抗原过表达水平以及靶抗原的特征等。

提高选择灵敏度和特异性主要通过优化细胞筛选流程得以实现。除此之外,超大容量的抗体库对于细胞筛选的成功也至关重要。

（3）案例分享

该项目首先采用了固相筛选方式，经过三轮筛选，获得几十株unique scFv，随机挑选20株做phage-scFv FACS，检测到1株的抗体具有细胞结合活性（图4）。

图4 固相筛选抗体的FACS检测

第二次采用抗原过表达的细胞系进行筛选，经过三轮筛选，一次性获得上百株unique scFv，同样随机挑选20株做phage-scFv FACS，其中16株抗体检测到明显的细胞结合活性（图5）。

图5 过表达细胞筛选抗体的FACS检测

从案例中可以看出，相较固、液筛选方法而言，基于过表达细胞系的筛选方法，获得具有细胞结合活性抗体的概率更高。

结论 

噬菌体展示技术极大提高了筛选特异性抗体的效率，而基于细胞的抗体筛选技术经过十余年的发展，在特异抗体的选择和筛选方面进行了丰富的探索。

细胞筛选技术与各种抗体展示技术、组合化学以及高通量筛选技术的进步相得益彰，将是肿瘤相关抗体的筛选技术未来快速发展的潜在动力。

参考文献

1. Jones, M. L., Alfaleh, M. A., Kumble, S., Zhang, S., Osborne, G. W., Yeh, M., Arora, N., Hou, J. J., Howard, C. B., Chin, D. Y., & Mahler, S. M. (2016). Targeting membrane proteins for antibody discovery using phage display. Scientific reports, 6, 26240. https://doi.org/10.1038/srep26240

2. Even-Desrumeaux, K., & Chames, P. (2012). Phage display and selections on cells. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 907, 225–235. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-974-7_12