精准前沿丨基于突变的基因集预测多癌种免疫治疗生存获益及免疫应答

本期《精准前沿》栏目分享北京协和医院赵海涛研究团队发表于Genome Medicine（IF =11.12）上的一篇研究[1]，研究构建并验证了一个突变signature，预测接受免疫治疗患者的预后，并利用多维数据研究不同亚型潜在的免疫应答情况。

研究背景

免疫检查点抑制剂（ICI）改变了许多癌症的治疗方法。然而，ICI治疗的受益人群有限，因此很有必要筛选预测生物标志物对患者进行分类。目前，许多生物标志物，如肿瘤突变负荷（TMB），已作为指示性生物标志物应用于临床。但一些与免疫治疗耐药相关基因突变的高TMB患者对ICI治疗不敏感。因此，有必要超越TMB，鉴定对ICI治疗应答的特定遗传决定因素。

研究设计

该研究包含12,647例患者的基因组和临床数据。训练集1572例（包含9种癌种的免疫治疗患者），验证集932例（包含5种癌种的免疫治疗患者）。训练集用包含468个基因的MSK-IMPACT panel进行测序。

作者确定了一个基于突变的11基因集，可将患者分为高风险和低风险组。这11基因的突变与ICI治疗更好的应答有关，且该基因集被证明是ICI治疗后独立的预后因素。

研究结果

1. 识别可预测免疫治疗结果的突变基因集

首先，比较了训练集468基因在野生型和突变型的生存差异，得到98个与OS（整体生存）相关的基因；之后，LASSO COX回归分析进一步筛选，最终得到11个重要基因；通过COX回归分析，在11个突变基因集的基础上，对每个患者的风险评分进行量化。训练集中，高风险组患者的OS较低风险组患者短（图1B）。为了研究该基因集是局限于特定的群体还是适用于不同的人群，对不考虑年龄、用药类型、癌种的亚组分析表明，该基因集与ICI治疗患者的OS显著相关（图1C-E）。

图1. 基于突变的基因集生成和验证

2. 可预测免疫治疗结果的验证

为了进一步证实基于突变的基因集对预测免疫治疗结果的价值，在验证队列中进行评估发现，低风险组的OS比高风险组增加（图1F）。在基因集预测ICI治疗应答的研究结果发现，训练集中，低风险组与高风险组相比，ICI治疗的DCB（durable clinical benefit）显著增加（图1G），低风险患者也更有可能对ICI治疗产生反应（图1H）。这些结果在验证集中得到同样的结果（图1I, J）。

3. 基因集是免疫治疗独立的预后预测因子

接下来，作者验证了基于突变的基因集是否是免疫治疗反应的独立预测因子。在训练和验证集中，单因素COX回归分析显示，该基因集与OS相关。在校正药物类型、肿瘤类型和TMB这些变量后，多因素COX回归分析显示，该基因集仍然是独立的预测因素，证实了其独立预测ICI预后的稳定性（图2A, B）。为确定哪个因素具有最好的预测性能，利用C-index比较基于突变的基因集和TMB、药物类型的性能。C-index结果显示，训练集和验证集中，基于突变的基因集均比TMB和药物类型更准确地预测预后（图2C, D）。

图2. 基于突变基因集与其它特征之间的关系

4. 基于突变基因集、疾病分期、CTL和6-IFN-g基因signature可联合预测ICI治疗临床获益

考虑到疾病分期、CTL和6-gene IFN-g signature已被证明可以高度预测ICI治疗的应答，作者推测它们可能在预测免疫治疗的反应中发挥协同作用。作者通过诺莫图，将基于突变的基因集与疾病分期、CTL和6-gene IFN-g signature相结合，为临床医生提供定量预测ICI治疗患者OS的方法。图2E是Riaz队列构建的诺莫图，图2F的校准曲线显示实际和预测的结果一致性，表明这些signature应整合到ICI治疗的预测诺莫图中。

5. 高低风险组潜在的外在免疫景观

为了进一步探索免疫系统和基于突变基因集之间的关系，作者对TCGA队列进行了多组学分析，风险评分将TCGA队列分为高低风险组（图3A）。基因组水平上，低风险组的白细胞、淋巴细胞和TIL比例显著高于高风险组（图3B-D）。TIL比例的H&E染色结果与上述结果一致（图3E）。此外，低风险组的免疫刺激细胞（如CD8 T细胞）比例也显著高于高风险组（图3F）。用Danaher等人的免疫浸润评分(图3G)和免疫特征评分（图3H）进一步检验上述结果，发现低风险组的免疫细胞丰度更高。然后利用无监督聚类对TCGA队列患者的免疫特征评分进行聚类，结果聚类为高低两种免疫浸润模式（图3I），且高免疫浸润在低风险组显著富集（图3J）。

图3. TCGA队列中高低风险人群的免疫状况

此外，低风险组在癌组织的免疫signature明显高于癌旁；相反，高风险组在癌组织的免疫signature明显低于癌旁组织的（图4A）。低风险组的免疫活动相关性显著高于高风险组（图4B, C）。GSEA结果显示，低风险组中有13条通路显著富集，包括6条免疫相关通路，例如“自然杀伤细胞介导的细胞毒性”等（图4D）。低风险组肿瘤与显著较高的CYT评分相关，高风险组中的成纤维细胞数量现在增加（图4E, F）。根据这些结果，低风险组丰富的免疫细胞，可以响应ICI治疗，而成纤维细胞可能有助于高风险组的逃逸。低风险组的趋化因子表达较高（图4G, H），因此，作者推测低风险组趋化因子的富集可能引发免疫反应。

图4. 高低风险组潜在的外在免疫景观 

6. 高低风险组潜在的内在免疫景观

比较了两组间决定肿瘤免疫原性的一些潜在因素。低风险组的突变和新抗原负荷以及TCR、BCR多样性均显著高于高风险组，但高风险组的CNV负荷和非整倍体均高于低风险组（图5A）。这一结果与前人的研究一致，即肿瘤非整倍体与免疫治疗以及免疫逃避标志物反应降低有关。此外，高风险组的肿瘤异质性高于低风险组，这进一步支持了这样的观点，即在存在细胞溶解活性和较少的主动浸润免疫细胞的情况下，肿瘤会促进异质性的发展。为进一步了解高低风险组的突变过程，根据体细胞突变数据描述突变特征，并在TCGA队列中确定了四种不同的突变模式（图5B）。这四种突变信号在低风险组中出现的频率明显高于高风险组（图5C）。此外，还发现免疫检查点分子(如PD-1、PD-L1和CTLA4)和共刺激分子在低风险组中表达更高（图5E）。

图5. 高低风险组潜在的内在免疫应答和逃避景观 

7. 高低风险组的拷贝数特征

在高低风险组检测到显著差异的染色体变异（图6A）。低风险组观察到特征良好的免疫基因（如PD-L1 (9p24.1)和PD-L2 (9p24.1) ）的局部扩增峰（图6B, C）。对特异扩增的基因进行GO功能注释，低风险组显著富集了2个免疫相关的生物学过程，高风险组显著富集在“成纤维细胞增殖正调控”这一生物过程，没有富集在任何免疫相关的生物学过程（图6E）。在TCGA队列的mRNA表达水平上，低风险组PD-L1和PD-L2 mRNA表达显著升高(图6G)，与CNV数据一致。这一发现表明肿瘤中的CNVs有助于观察到的免疫浸润差异。

图6. 高低风险组拷贝数变异

讨论

该研究是首次使用独立队列研究不同肿瘤类型的综合突变基因集。通过PSM算法、分层分析和多因素COX回归分析，对基于突变的基因集在不同类型肿瘤中的应用性能进行了测试，结果表明基于突变的基因集是可靠的。

本研究具有以下创新和实际应用价值。首先，使用不同类型的肿瘤(如NSCLC（非小细胞肺癌）、黑色素瘤和肾细胞癌)，它们代表了使用ICI治疗的最常见类型的癌症。其次，多重生物标志物预测模型的应用需要了解临床实践中影响高通量分析准确性和精密度的因素。mRNA表达计算的风险评分公式和阈值不适合使用其它类型的数据进行验证。因此，本研究开发了一种基于突变的基因集来预测ICI治疗的临床疗效。上述突变的构成既不受组织类型的影响，也不受任何其他生物标记物的调整。基于突变的基因集的风险评分公式和阈值可以用其他肿瘤分析方法验证，如DNA测序和单核苷酸多态性微阵列分析。因此，基于突变的基因集不受技术变化的影响，即使在不同的中心使用不同的平台时也是如此。第三，在实践中，基于突变的基因集避免了在患者不太可能有反应的情况下，将患者暴露于潜在的免疫相关不良反应，并使患者能够更快地匹配到可能更有效的治疗。第四，比较了基于突变的基因集和其他可以预测免疫治疗因素的预测性能，发现基于突变的基因集的预测性能优于所有这些因素。

本研究的几个局限性。首先，由于一些突变可能在某些肿瘤类型中富集，本研究的最初目标是创建一个panel，而不是识别单个基因(如BRAF)，因为前者可以包含更多的基因来预测不同类型肿瘤的预后。其次，虽然探索了基于突变的基因集中的11个基因的免疫景观，但仍然需要在体内、外功能实验中阐明每个基因影响免疫治疗的分子机制。第三，还应通过免疫组化检测致癌通路的富集分数和免疫检查点的表达模式。

结语

本研究提出的基于突变的基因集是第一个系统识别的综合基因组标志物，可用于评估泛癌种的ICI治疗效果。这项研究也是接受ICI治疗癌症患者（无论是单药治疗还是抗PD-1和抗CTLA-4联合治疗）最大的预后模型发现项目。将基于突变的基因集与TMB、药物类型相结合的诺莫图，可以帮助临床医生选择对ICI治疗可能有强烈响应的患者。此外，还揭示了高低风险组人群不同的免疫情况，特定的基因组改变可能驱动这些微环境的形成。总之，这项工作提出了一种新的肿瘤分类方法，有可能指导ICI治疗决策。 END 

参考文献：

[1] Long, J., Wang, D., Wang, A. et al. A mutation-based gene set predicts survival benefit after immunotherapy across multiple cancers and reveals the immune response landscape. Genome Med 14, 20 (2022). https://doi.org/10.1186/s13073-022-01024-y

撰写丨 花花Liu

编辑、排版丨SX