【神麻人智】全身麻醉可使L5皮层锥体神经元选择性地整体产生同步活动

摘要

全身麻醉诱导的意识消失，在行为上产生的作用是整体或全脑范围的，但对于特定类型的皮层神经细胞是否能够产生相应整体活动的改变，目前尚不清楚。本研究发现了在活体小鼠中多种全身麻醉药物能够使第 5 （L5））皮层锥体神经元产生自发性活动，但其他皮层神经元却不具有类似作用。这种增强的神经元同步是非周期性的，且全脑范围均存在，但L5层锥体神经元的突触前皮层神经元在其中并不发挥作用。全身麻醉诱导或苏醒的转换过程中，L5的同步性与意识消失和恢复一致，顶部树突和基部树突的活动是同步的，但仅有基部树突的活动与躯体活动相关。因此，L5做为皮层的主要输出，本研究结果表明L5锥体神经元的全脑同步性改变可能在诱导全身麻醉产生的意识丧失中发挥着重要作用。

背景

意识处理依赖于大脑皮层活动，皮层共分为6层，由不同类型的神经元所构成，并参与每一皮层的微环路。在感觉皮层的微环路中，信息由丘脑输入至L4，通过L2-3，至L5-6.每一层的兴奋性神经元接受来自同一层的兴奋性与抑制性神经元的输入。L1由L2/3-L6胞体的兴奋性神经元树突、远程轴突和抑制性神经元所构成。L5兴奋性锥体神经元(excitatory pyramidal neurons, PNs)根据输出不同分为三类，脑内神经元(IT)向其他皮层区域提供长距离输出; 锥体束(PT)神经元连接丘脑和其他皮层下区域; 近距离投射神经元主要与其他L5-PNs形成局部反复连接。

虽然多种全身麻醉药物均能够诱导意识消失，但其相关的分子机制却差异很大；异氟烷（ISO），芬太尼-美托嘧啶-咪达唑仑（FMM），氯胺酮-甲苯噻嗪（Ket-Xyl），其中ISO作用于GABAA受体、FMM中的芬太尼作用于阿片受体、美托嘧啶为a2受体激动剂，而咪达唑仑作用GABAA受体，氯胺酮为NMDA受体拮抗剂，甲苯噻嗪同样是a2受体激动剂。

尽管不同全麻药物的分子机制不同，全身麻醉诱导的意识消失能够产生相似的皮层活动，如EEG、ECoG和皮层内胞外电极记录显示皮层活动的频谱变慢，这种转变是由于皮层的同步性增强，在意识消失时出现，苏醒时则被逆转。既往研究主要通过使用EEG、ECoG、fMRI和皮层内电极记录单个神经元或神经元群，但这些方法在神经元群体内的空间分辨率有限或缺乏细胞类型特异性。因为不同类型的细胞在控制皮层微电路中的信息流动方面有不同的功能作用。因此，在活体单神经元水平测量特定类型神经元的活动将为了解无意识状态的神经元相关性提供线索。

结果

麻醉诱导L5-PNs神经元同步化

为了解全身麻醉对皮层特异类型神经元群体自发活性变化，研究者使用活体双光子钙成像研究不同品系小鼠视觉皮层在清醒、麻醉及黑暗状态下的神经活动（Figure 1A），为了定位整个L5-PNs皮层，使用Rbp4-Cre KL100的小鼠且注射腺病毒依赖PHP.eB 血清型共表达GCaMP7s (AAV-CAG-FLEX-GCaMP7s)。

为明确全身麻醉的共同作用，研究者比较了FMM，ISO，Ket-Xyl诱导的手术麻醉深度下的L5-PNs 神经元活动，各种麻醉状态下EEG脑电频谱表现为θ(3.5–10 Hz) 和 δ(0.5–3 Hz) 频段比例的下降（Figure 1B）。清醒状态下，不同L5-PNs神经元随着时间，活性改变并不相同，但在全身麻醉状态下，不同L5-PNs神经元的钙活动表现具有同步性。为了量化，研究者计算了每个神经元的活动与记录的所有其他神经元平均活动的相关性，定义为 “神经元同步性”。研究发现所有3种全麻状态，神经元同步性均显著高于清醒状态(Figure 1D)。

Figure1: 麻醉诱导L5-PNs神经元同步化. （A）Rbp4-cre 小鼠，注射PHP.eB AAV-CAG-FLEX-GcaMP7s, 在黑暗时的成像图；（B）EEG脑电频谱改变，全身麻醉使θ/ δ显著下降；（C）单个神经元钙活动的变化（示例）；（D）神经元的同步性

L5-PNs神经元同步化与意识消失同时发生；随麻醉苏醒神经元同步化消失

研究者探讨了视后皮层区麻醉诱导期间神经元同步化与意识消失的相对时间变化。为比较从清醒到麻醉状态神经元的同步化进程，研究者利用ISO麻醉Rbp4-Cre小鼠，以Figure 1D方法定义清醒与麻醉状态神经元同步化水平的划分，Figure 2A表示Rbp4-Cre小鼠由清醒至麻醉转变时神经元同步化的增强，小鼠行为学的评估包括：监测眼睛、胡须及体动是否消失，25%-75%小鼠消失的时间为68-118s（Figure 2B）；监测脑电改变（Figure 2C），与小鼠行为学改变相一致（Figure 2D）。

随后，研究者使用相同的方法探讨了麻醉苏醒过程，ISO停止后神经元同步化水平下降（Figure 2E）；25%-75%小鼠出现体动的时间为23-70s（Figure2F）。神经元同步化的转变与小鼠脑电频谱的改变密切相关（Figure 2H）。 

Figure 2：神经元同步化的转变与意识消失和麻醉苏醒同时发生；（A-D）：ISO麻醉诱导的意识消失与神经元同步化同时发生，小鼠行为学及脑电频谱也随之转变；E-H，ISO麻醉苏醒的过程，神经元同步化与麻醉诱导相反。 

各类全身麻醉对L1, 2/3, 4，6及皮层抑制性神经元均不产生同步化增强

那么这种全身麻醉所诱导的神经元同步化增强，是否为L5层皮层神经元特有呢？为了探究这个问题，研究者使用不同品系的转基因小鼠，分别对L1, 2/3, 4，6及皮层抑制性神经元，进行活体成像，Fig3C-E表示，各类全身麻醉（FMM，ISO，Ket-Xyl）对以上各皮层神经元的作用，与清醒状态相比同步化程度并无明显改变。

Figure 3：B-F，左边图示，各层神经元成像方法；中间图示 ，各类全麻下神经元活动示例；右侧图示, 每一单个神经元同步化水平；各层成像所使用的小鼠为 (B)L1: Gad2-Cre. (C) L2/3: Cux2-Cre. (D) L4: Scnn1-Cre. (E) L6: Ntsr-Cre. (F) 皮层抑制性神经元: Gad2-Cre；（G-I），与L5层皮层神经元相比，其他各层神经元活性变化以及神经元同步的标准化距离。

L5-PNs突触前皮层神经元在全麻所诱导的同步化中不发挥作用

L5-PNs 的大部分皮层输入来自与其内部的网络链接，同时也接收来自其他皮层的输入；为了研究全麻状态下L5-PNs 输入的神经元同步性，研究者利用单突触与逆行跨突触狂犬追踪病毒，驱动钙指示剂在L5-PNs突触前神经元表达（Figure 4A-B），L5-PNs突触前神经元在全麻与ISO麻醉状态下单个神经元活性的改变的示例（Figure 4C），ISO能够使得其活性显著降低（Figure 4D-E），不表现为同步化增强，提示L5-PNs突触前神经元在全麻诱导的L5-PNs同步化并不发挥相关作用。

Figure 4：L5-PNs突触前神经元在全麻诱导的同步化中并不发挥相关作用：（A-B），研究策略，特异性驱动钙离子指示剂在L5-PNs突触前神经元表达；（C），L5-PNs突触前神经元在全麻与ISO麻醉状态下单个神经元活性的改变的示例；（D-E），ISO能够使得其L5-PNs突触前神经元活性显著降低，并不呈现同步化作用

全麻诱导的L5-PNs神经元同步化增加在各皮层脑区中同步

随后，研究者对皮层的多个脑区进行宽场钙成像，研究结果表明全麻诱导L5-PNs的神经元同步化为跨脑区存在，具体包括视觉、体感、运动等相关皮层（Figure 5C）

Figure5：A-B，通过向Rbp4-Cre小鼠， 注射PHP.eB AAV-CAG-FLEX-GCaMP7s.对各皮层脑区（视觉、体感、运动等）进行宽场钙成像； C，全麻药物诱导的L5-PNs同步化在各皮层脑区亦同步。

最后，研究者发现L5-PNs顶部树突和基部树突的活动是同步的，但仅有基部树突的活动与躯体活动相关。因此，本研究主要结果提示皮层L5锥体神经元的全脑同步性改变可能在诱导全身麻醉产生的意识丧失中发挥着重要作用。

编译，审校：罗猛强，邓萌

原文链接：Bharioke A, Munz M, Brignall A, et al. General anesthesia globally synchronizes activity selectively in layer 5 cortical pyramidal neurons. Neuron. 2022 Apr 12:S0896-6273(22)00303-8. doi: 10.1016/j.neuron.2022.03.032.

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