不同的肠道微生物群与阿苯达唑-伊维菌素对土传蠕虫病的疗效相关

导读  

经土壤传播的蠕虫感染是一个巨大的负担，世界上超过四分之一的人口处于危险之中。标准治疗(阿苯达唑)的治愈率较低；因此，正在研究一种更有效的联合疗法(阿苯达唑和伊维菌素)，但显示出不同的治疗效果，没有证据表明存在内在寄生虫耐药性。本研究分析了鞭虫(Trichuris trichiura)和钩虫感染患者的微生物群，发现不同的肠型与疗效之间存在关联。来自老挝Pak-Khan地区的80例与钩虫共同感染的T. trichiura感染患者接受了阿苯达唑(n=41)或阿苯达唑-伊维菌素联合治疗(n=39)。采用16S rRNA基因测序、qPCR和鸟枪法测序对治疗前/后的粪便样本进行分析，以监测治疗效果。我们确定了三种细菌肠型，并表明治疗前肠型与联合治疗鞭虫(CRET1=5.8%；CRET2=16.6%；CRET3=68.8%)和钩虫(CRET1=31.3%；CRET2=16.6%；CRET3=78.6%)感染的疗效相关。本研究表明，治疗前肠型可以预测联合治疗鞭虫和钩虫感染的治疗结果。

论文ID

原名：Different gut microbial communities correlate with efficacy of albendazole-ivermectin against soil-transmitted helminthiases

译名：不同的肠道微生物群与阿苯达唑-伊维菌素对土传蠕虫病的疗效相关

期刊：Nature Communications

IF：14.919

发表时间：2022.2.25

通讯作者：PierreH. H. Schneeberger ＆ Jennifer Keiser

通讯作者单位：瑞士热带病与公共卫生研究所；瑞士巴塞尔大学

DOI号：10.1038/s41467-022-28658-1

实验设计

结果

抽样结果和研究特征。2019年1月至5月间，老挝琅勃拉邦区Nambak 10个村庄的人接受了T. trichiura检测。549人被纳入并随机分配到单药治疗(阿苯达唑)或联合治疗(阿苯达唑-伊维菌素)。在第一次给药后28天内，每天收集88名患者的治疗后粪便样本，其中80名患者被纳入微生物组评估(图1)。其中，86.2%(n=69)与钩虫共同感染，40%(n=32)与人蛔虫(A. lumbricoides)共同感染，8.7%(n=7)与麝猫后睾吸虫(Opisthorchis viverrini)共同感染。治疗组在性别、年龄、寄生虫的基线感染强度方面保持平衡，组间未观察到显著差异(表1)。同样，治疗后期间的采样依从性在两个治疗组间具有可比性(补充图1)。 

图1 试验概述 描述用于微生物组分析的患者数量的试验流程。

表1 队列描述。

y ，年； ATX ，治疗前 1 个月内进行抗生素治疗； EPG ，每克粪便中的虫卵数； SD ，标准差， arit ，算术平均值； geom ，几何平均值； I.i ，根据世界卫生组织标准确定的感染强度。   

组成聚类和聚类特有的分类特征。治疗前基于分类组成的无监督聚类能够将潜在的群落结构识别为三个不同的集群或肠型(ET1-3)，如图2A所示。每种肠型所代表的比例在两个治疗组之间具有可比性(补充图2)。当使用该数据集上的随机森林模型评估时，这种基于肠型的分类的准确性为78.75%，Kappa统计量为62.93%。就分类准确度而言，最重要的分类特征包括粪杆菌属Faecalibacterium(2.704%)、埃希氏菌/志贺氏菌复合体Escherichia/Shigella complex(2.613%)、普雷沃氏菌属Prevotella(1.814%)、Phascolarctobacterium(1.082%)和[Eubacterium] coprostanoligen group(1.044%)(图2B)。3种肠型之间差异丰富的8个属中(图2C)，ET1中Faecalibacterium和Prevotella的相对丰度较高(分别为P=2.61E-09和7.55E-05)，ET2中Escherichia/Shigella的相对丰度较高(P=1.33E-07)，而[Eubacterium] coprostanoligenes group在ET3中富集(P=7.55E-05)(图2C)。将来自两个治疗组的样本与PERMANOVA(r2 = 0.013，P = 0.38)进行比较，分类组成是均质的，如图2D所示。ET2与ET1、ET3之间的α多样性比较，显示Shannon多样性较低，Berger-Parker优势指数较高(补充图3)，而ET1与ET3之间差异不显著。图2 基本组成结构及其分类学特征。 

A 鞭虫感染患者治疗前肠道微生物群落组成。 使用 Bray-Curtis 相异度生成 cladogram 图。 

B 使用随机森林模型在该数据集中的分类性能。 根据个体对样本分类的贡献，对分类特征进行排序。 

C 使用组间比较的 Kruskal-Wallis 检验结合线性判别分析效应大小 (Lefse) 发现细菌属在其中一种肠型中富集。 

D 基于 Bray-Curtis 相异度的基线样本非度量多维尺度排序图。 所标记的属在两种肠型中均有富集。 治疗组 A= 阿苯达唑和伊维菌素，治疗组 B= 阿苯达唑， ET 肠型。 特定分类群的绝对丰度和细菌总数证实了不同群落结构的存在。通过qPCR评估Faecalibacterium (FAEC)、Escherichia (ESCH)和Prevotella (PREV)的绝对丰度，证实了基于16SrRNA基因测序的肠型分类(图3A)。例如，ET2中的ESCH显著高于ET1和ET3(P = 0.001和0.002)。ET1组中FAEC和PREV均显著高于ET3组(P = 0.001和P =0.004)。

然后，我们检测了从这三个目标和总细菌量(16S)获得的qPCR值是否可用于将样本划分为16SrRNA基因测序确定的三种肠型之一。基于qPCR的随机森林模型将83.1%的样本(Kappa=0.72)准确分类为肠型1-3，这与基于测序的分类得到的指标相似。该模型的受试者工作特征曲线下面积(AUC)在ET1和ET2之间为1(95%CI：NA)，在ET1和ET3之间为0.88(95%CI：0.79-0.97)和在ET2和ET3之间为0.91(95%CI：0.82-1)(图3B)，表明基于qPCR的分类作为高通量测序的替代方案适用于已确定的肠型。 已确定的肠型与鞭虫和钩虫治愈之间的联系。对于接受阿苯达唑单药治疗的鞭虫(图4A，右半图)或钩虫感染(图4B，右半图)患者，我们没有观察到任何治愈率(定义为治疗后第14-28天内，每克粪便中的虫卵数(EPG)为零)与ET之间的关联。然而，大多数接受联合治疗(阿苯达唑-伊维菌素)并治愈两种STH感染的患者，其肠道微生物组成被归类为ET3治疗前。这种观察结果与鞭虫(图4A，左半图)和钩虫感染(图4B，左半图)相似。与基线ET3患者相比，鞭虫感染治愈的可能性显著降低(P=0.0002)，优势比(OR)为0.03(95%CI: 0.01-0.2)。在ET1/ET3和钩虫治疗结果之间观察到类似的，尽管相关性较弱(P=0.025)，OR为0.14(95% CI: 0.03-0.66)。我们以90%的虫卵减少率(ERR)进行了类似的分析，作为对治疗结果的估计。在联合治疗组中，我们发现两种感染的肠型和ERR之间存在显著的相关性，类似于肠型和治愈率之间的相关性(补充图4)。对于接受单药治疗的患者，我们没有发现肠型和ERR之间的任何关联。测定的基线PREV和FAEC绝对丰度与联合治疗后第14至28天的平均虫卵数相关，Spearman相关系数分别为0.416(P=0.009)和0.275(P=0.09)(补充图5A)。在单药治疗组中没有观察到T. trichiura治愈与微生物绝对丰度之间的相关性，在两个治疗组中也没有观察到钩虫治愈与微生物绝对丰度之间的相关性(补充图5B-D)。 在阿苯达唑-伊维菌素治疗组中，失败或成功相关肠型中富集物种水平特征。为了确定失败相关肠型1-2与成功相关肠型3之间的物种水平差异，我们从阿苯达唑-伊维菌素治疗组收集的样本中生成鸟枪法测序数据。除了先前观察到的来自Prevotella(ET1中的P. copri)、Faecalibacterium(ET1中的F. prausnitzii)、Escherichia/Shigella(ET2中的大肠杆菌)和瘤胃球菌Ruminococcus(ET3中的R. torques)的富集特征外，当两组进行比较时，我们发现唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、Coprococcus eutactus、Roseburia faecis、Dorea longicatena和Eubacterium halii在ET1或ET3中显著富集(图4C)。当ET3与ET2比较时，Coprococcus eutactus在ET3中也减少，而Anaerostipes hadrus则在ET3中富集。图 3 分类特异性和总细菌 qPCR 将治疗前样本分类为与治疗相关的类别。 

A 用定量 PCR(qPCR) 检测总细菌和分类群特异性密度，按肠型分类。 采用 Mann-Whitney 检验比较肠型 1(n=17) 、肠型 2(n=6) 和肠型 3(n=16) 的绝对丰度。 每个框的下限和上限分别代表 第一四分位数 和 第三四分位数 ，其中的线表示中位数。 线段表示最小值和最大值。 

B 使用 qPCR 值进行肠型分类的敏感性和特异性。 PREV ， Prevotella 属 qPCR 靶标； FAEC ， Faecalibacterium 属 qPCR 靶标； ESCH ， Escherichia coli qPCR 靶标； 16S ，总细菌 qPCR 靶标。   图4 土壤传播的蠕虫治愈与治疗前肠型(ET)之间的关联以及每种肠型的物种水平特征。

A鞭虫感染治疗结果与基线ET之间的关联。B治疗前测定钩虫治疗结果与ET的相关性。治愈率定义为治疗后14至28天期间粪便中是否有虫卵(=治疗后第14至28天期间收集的样本中每克粪便中的平均虫卵数)。

B肠型之间的物种水平差异。Fisher双侧精确检验，括号中显示优势比的95%置信区间。饼图上的标签表示每组的患者人数。n，患者数量；OR，优势比。 按治疗前肠型分层的治疗结果的Cox比例风险模型。

在治疗后28天的两个连续样本中没有检测到虫卵被定义为鞭虫感染治愈，测定的风险比表明，与ET1相比，接受联合治疗的患者在出现ET3时虫卵清除速度更快(HR=18.12,P=0.005)。当调整诸如性别、年龄和感染强度等潜在的混杂因素时，这种关联仍然成立(表2)。与ET1患者的虫卵清除率相比，ET3患者的钩虫治疗也观察到更快的清除率(HR=3.75,P=0.016)。在调整性别(P=0.04)、年龄(P=0.003)、感染强度(P=0.017)和基线EPG(P=0.039)后，这种相关性仍然成立。在联合治疗组中，出现ET2和ET1的鞭虫和钩虫感染患者早期虫卵清除率没有差异。在单药治疗组中，我们没有观察到肠型与治愈率之间的任何联系。单药治疗组中治疗前/治疗后EPG计数强烈相关，但在联合治疗组中不相关，这与观察到的治疗效果一致(补充图6)。 成功和失败相关肠型与每日治疗后每克粪便中虫卵计数的相关性。通过生存分析，我们证实使用阿苯达唑和伊维菌素治疗，出现ET3的患者比出现ET1和ET2的患者更有可能更快、更有效地治愈鞭虫感染(P=0.0002；图5,左图)。同样的观察结果也适用于钩虫感染(P=0.009；图5,右图)。观察到对鞭虫感染的总疗效为33.3%。ET1患者ET特异性疗效为5.8%，ET2患者为16.6%，ET3患者为68.8%。对钩虫的总疗效为47.2%。ET3患者在治疗后14天的CR最高，为78.6%，而ET1和ET2患者在该时间段内分别只有31.3%和16.6%的治愈率。每日的虫卵模式也很大程度上反映了这些结果(图5B)。无论治疗组或基线肠型如何，治疗后立即观察到EPG计数急剧下降。对于鞭虫EPG计数，联合治疗组(5天平均EPG为98.2%)比单药治疗组(5天平均EPG为72.9%)下降更明显，这与在提出的随访检查(14-28天)中观察到的联合治疗的疗效增加有关。值得注意的是，在两种感染类型中，ET1患者的EPG计数在最初下降后增加，ET2患者的EPG计数在较小程度上下降。比较不同治疗组间钩虫EPG计数下降没有差异，联合治疗和单药治疗在第5天的平均下降分别为99.1%和99.3%。

表2 使用治疗前(pre-Tx)肠型(ET)预测虫卵清除时间。

清除 定义为连续两个样本没有检 测到虫卵 ( 鞭虫或钩 虫 ) ，并且在第 14 至 28 天之间的平均虫卵 计数为零。 高于 1 的显著风险比表明患者正在以更快的速度到达事件 ( 清除虫卵 ) 。 ALB-IVE ，阿苯达唑 - 伊维菌素， ALB ，阿苯达唑； ref. ，参考类别； HR(95% CI) ，风险比 (95% 置信区间 ) ； T x ，治疗。图5 治疗前肠型与治疗后鞭虫和钩虫每日虫卵数的关系。

A Kaplan-Meier曲线显示随时间推移感染患者的剩余比例，按基线肠型分层。鞭虫治疗在左边，钩虫治疗在右边。

B按治疗前的肠型分层，鞭虫(上两图)和钩虫(下两图)的日平均虫卵数。每日虫卵计数显示为联合治疗(阿苯达唑和伊维菌素;左半图)和单药治疗(阿苯达唑;右半图)。黑色虚线表示每种寄生虫中度感染的下限和上限。ND，未检测出；post-tx，治疗后；ALB，阿苯达唑；IVE，伊维菌素。

利用KEGGorthology术语(KO)对这三种肠型进行功能分析，结果显示，三种肠型共享了大量的KO(n=3823或80.8%;图6A)。ET3特有KO比例最高(4.4%)，其次是ET1(2.6%)和ET2(1.4%)，表明ET3的功能多样性最高，而以大肠杆菌为主的ET2的功能多样性最低。但在数量上，ET3和ET2之间的每百万基因拷贝数变异(27.2%KO差异显著)高于ET3和ET1之间的变异(0.96%KO)，表明尽管存在明显的分类学差异，但ET3和ET1之间存在功能冗余(图6B)。使用PERMANOVA进行比较时，在群落水平上观察到不同肠型之间的显著差异(图6C)。但与失败相关的ET1和成功相关的ET3(R2 =0.073, P =0.009)相比，ET2与ET1和ET3的R2分别为0.338(P =0.001)和0.347 (P =0.001)，差异更为显著。在图6D中，我们发现肠型和参与遗传信息处理、代谢以及信号传导和细胞过程的KO之间的高水平群落代谢潜力相似，占所有肠型已识别通路的80%以上。我们发现以前与文献中阳性STH感染状态相关的特定通路中，肠型之间存在显著差异。例如，与ET3相比，在失败相关的ET1和ET2中三条通路包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、原核碳固定以及花生四烯酸代谢显著富集(图6E，补充图7中提供了丰度差异通路的完整列表)。

图6 肠型间代谢潜能的比较。

A维恩图显示了治疗相关肠型之间KO术语的定性重叠。

B热图突出显示不同肠型之间KO水平的数量差异(标准化计数的差异)。使用Deseq2进行比较，并采用Benjamini-Hochberg程序对p值进行多重检验偏差校正。

C利用主成分分析显示KO在群落水平上的差异。为了量化这些差异，我们进行了PERMANOVA分析。

D柱状图显示高水平KEGG通路的平均相对丰度，按肠型划分。为了清晰起见，只显示了大于2%的序列比例。

E以往研究中与阳性土传蠕虫感染状态相关的代谢通路相对丰度的肠型比较。采用Kruskal-Wallis检验结合Benjamini-Hochberg多重检验偏差校正来识别差异，计算倍数变化以显示相应的效应大小。ET1-3，肠型1-3；FC，倍数变化；Ref.，参考。

讨论

本研究首次调查了用于治疗人类鞭虫和钩虫感染的基本药物治疗失败的肠道微生物决定因素。我们的结果代表了我们对驱虫治疗背景下肠道微生物-药物相互作用的理解有了重大改进。主要发现是(i)在这种情况下，在特定分类群的相对丰度和绝对丰度方面发现了分类学上不同的群落，(ii)治疗前群落组成或肠型与阿苯达唑-伊维菌素联合治疗鞭虫和钩虫感染的治疗结果有关。这些观察结果表明，在使用以伊维菌素为基础的治疗时，粪便样本的治疗前微生物组成与鞭虫和钩虫的治疗效果密切相关。 伊维菌素是一种功能和化学性质复杂的药物。例如，最近的文献描述了该药物的重新定位以治疗广泛的未被临床试验认可的非寄生虫病。因此，这可能导致全球伊维菌素消费量的增加，事实上，了解伊维菌素与肠道微生物群的相互作用对公共卫生健康更加重要。此外，该药物含有一个16-元大环内酯基团，其结构类似于重要的大环内酯类抗生素，如红霉素(14-元内酯)、阿奇霉素(15-元内酯)、酪氨酸/交沙霉素(16-元内酯)等。虽然这仍有待在功能上进行验证，但它提出了一个问题，即细菌和伊维菌素之间是否可能发生耐药性相互作用，从而导致药物失活，这可能是通过药物对失败相关类群潜在的抑菌杀菌活性来驱动的。进一步的研究应该调查这一直接机制，因为一些与失败相关的分类群是革兰氏阳性菌，它们是大环内酯类抗生素的已知靶标，因此可能对该药物敏感。耐药性并不是唯一的可能性，最近在唾液链球菌(S. salivarius)中描述的一种机制，即药物在细菌细胞中的生物隔离也可能导致治疗效果下降。最后，群落水平的代谢潜能可能是另一种潜在的相互作用机制。目前，关于肠道微生物群和蠕虫定殖相互作用的数据相当缺乏，主要来源是使用高通量测序方法比较感染和非感染患者的代谢组成的观察队列。在这项研究中，我们强调了在代谢通路丰度方面的群落特异性差异，这反过来又可能与治疗结果有关。

虽然评估因果关系将需要后续研究，但我们表明，本研究中确定的三种治疗相关肠型的代谢潜力存在显著差异。对于与其他两种肠型ET1和ET3表现出深刻差异的失败相关的ET2来说尤其如此。此外，我们发现，与ET3(之前与阳性STH感染状态相关)相比，两种失败相关表型中均有一些特定的通路富集。虽然这还有待进一步验证，但我们可以假设，某些微生物组成和相关的代谢特征可以为定殖的寄生虫提供或多或少的许可环境，并导致驱虫治疗的效果受到调节。值得注意的是，这种微生物组-药物相互作用存在于定殖小肠的钩虫以及位于大肠开始处的盲肠中的鞭虫。这有利于更广泛的相互作用，而不是局限于局部的活动。未来研究的另一个重点还包括了解在34-86%对阿苯达唑/伊维菌素治疗无反应的患者中，有多少可以归因于潜在的细菌驱动的相互作用。这些信息将有助于确定如何通过基于微生物群的治疗来改善治疗反应。 这项研究的另一个重要意义是，作为抗寄生虫药物销售的伊维菌素也可能有助于选择交叉耐药的细菌分离株，这可能会阻碍抗生素管理项目的努力。这一点尤其重要，因为它广泛用于MDA活动。如果这种耐药性相互作用在功能上得到验证，伊维菌素和相关衍生物莫西菌素也应该被考虑在抗菌管理工作中。这可以通过对耐药性的遗传/表型决定因素进行治疗前筛选来实现。 然而，本研究有几个重要的局限性。首先，我们的观察是基于样本量相对较少的队列(n=80)和有争议的肠型概念。在实践中，这意味着我们在本研究中提出的基于β-多样性的肠型分类可能会在未来的研究中发生改变。此外，在这种情况下确定的失败的分类决定因素可能是特定于老挝的PakKhan村，可能是无法推广的。虽然我们用不同的技术证实了我们与分类学相关的观察结果的稳健性，但还需要在不同的环境下进行进一步的研究，以确定低阿苯达唑-伊维菌素治疗效果的常见微生物/遗传因子。其次，我们没有研究内在的蠕虫抗药性。虽然目前尚无已知的筛选鞭虫和钩虫对伊维菌素耐药性的靶标，但我们不能排除寄生虫敏感性较低可能部分解释治疗效果降低的原因。虽然这是可能的情况，但我们与疗效相关的观察结果(66.7%失败)与之前关于该药物联合治疗失败的观察结果一致。由于迄今为止没有证据表明人类对伊维菌素产生了寄生虫抗药性，因此我们认为该研究环境代表了具有正常寄生虫敏感性的环境。 

综上所述，本研究表明，肠道微生物群组成是阿苯达唑和伊维菌素驱虫治疗效果的重要驱动因素。这些发现将有助于了解基于阿苯达唑和伊维菌素的治疗在很大一部分患者中失败的原因，同时仍是成功治疗STH感染的最有效选择之一。这将有望带来基于调节失败相关特征的新治疗机会，也许更重要的是优化这些强效药物的循证使用。

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