揭示LPL/WM中免疫球蛋白重链基因谱系及临床相关性

淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症(LPL/WM)是一种不常见的成熟B细胞淋巴瘤，大多数LPL/WM患者的临床病程为惰性，中位生存期为10年，但也有约10%-15%的患者进展较快。既往报告的不良预后因素包括高龄、B症状、贫血、低血清白蛋白、高乳酸脱氢酶(LDH)、高β2-微球蛋白、低血小板计数、高IgM水平和异常核型等。然而总的来说，LPL/WM的精确B细胞起源和分子发病机制仍不明确。

免疫球蛋白重链可变基因(IGHV)对于确定B-NHL的表位结合亲和力和B细胞分化至关重要。IGHV状态是肿瘤B细胞起源的证据，可反映转化前后肿瘤克隆的状态。例如，以种系免疫球蛋白基因为特征的疾病可能起源于初始B细胞，而IGHV基因突变的疾病则来源于对抗原刺激发生生发中心反应的B细胞。

不同B细胞肿瘤的IGHV序列已在人体中进行了广泛研究。慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者表现出高度偏态（skewed）的IGHV谱系，其体细胞超突变状态是一个依赖性预后因素。与突变IGHV患者相比，未突变IGHV患者治疗缓解率较低且PFS较短，但对含氟达拉滨免疫化疗的反应较好。此外部分患者位于中间区内，例如具有特异性IGHV基因IGHV3-21的患者预后相对较差，且与其突变状态无关。

与CLL的基因模式相似，IGHV重排的不同印记（imprints）及其临床相关性，在脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、毛细胞白血病(HCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)和滤泡性淋巴瘤中也已有报道。例如，SMZL患者主要使用（usage） IGHV1-2，IGHV4-34优先用于IGHV未突变的HCV变异患者。

但LPL/WM中的IGHV谱系与CLL和其他B细胞淋巴瘤不同，其特征为高IGHV突变率、IGHV3-23基因使用过度表达和短CDR3片段。

LPL/WM细胞起源于受到T细胞依赖性抗原选择的后生发中心记忆B细胞（post-germinal center memory B cells）。但由于LPL/WM的罕见性，已发表的关于IGH谱系的研究样本量有限。此外，IGH谱系对LPL/WM的临床相关性也基本处于未知状态。

为探索LPL/WM患者的IGHV谱系，并评价IGHV重排、遗传畸变与LPL/WM患者临床特征之间的相关性，邱录贵教授和易树华教授牵头了一项迄今为止最大样本量的研究，共纳入136例患者。文章近日发表于《BLOOD ADVANCES》。

研究设计

本研究共纳入了2012-2019中国医学科学院北京协和医院血液学研究所血液病医院162例LPL/WM患者。

在诊断LPL/WM时从样本中分离基因组DNA，使用QIAmp DNA blood Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)从新鲜冷冻骨髓(n= 151)、外周血单核细胞样本(n= 8)或福尔马林固定、石蜡包埋的淋巴结标本(n= 3)中提取DNA。后续检查纯度和扩增互补DNA。

PCR扩增、纯化后测序并进行分析。IGHV基因序列与IMGT中的同源序列）和IGBLAST数据库进行比对，与种系序列同源性< 98%的IGHV序列视为突变，而与种系序列同源性≥98%的IGHV序列视为未突变。

还进行了FISH核型分析和MYD88 L265P突变状态筛查。

研究结果

患者

162例患者中有136例(84.0%)获得了IGHV-D-J重排结果。136例患者的临床特征见表1。中位年龄为62岁，根据IPSS风险评分，分别有18.3%、38.2%和43.5%的患者为低危、中危和高危。

VH、DH和JH基因片段使用情况

作者收集了所有136例LPL/WM患者的VH、DH和JH链基因片段使用（gene segment usage）及体细胞超突变率(somatic hypermutation，SHM)数据。IGHV基因谱系分析显示，IGHV3使用是优势亚组(82/136，60.3%)，其次是IGHV4 (33/136，24.3%)、IGHV1 (13/136，9.6%)、IGHV6 (5/136，3.7%)、IGHV2 (2/136，1.5%)和IGHV5 (1/136，0.7%)（图1A）。与既往研究一致，IGHV3-23 (15.4%)、IGHV4-34 (10.3%)和IGHV3-7 (8.1%)在LPL/WM患者中过度表达。IGHV片段的分布如图1B所示。值得注意的是，5个IGHV片段，包括IGHV3-23、IGHV4-34、IGHV3-7、IGHV3-30和IGHV3-74，几乎占患者的一半(48.5%)。

作者比较单个IGHV基因在LPL/WM患者中的使用与正常人B细胞Ig重链谱系的使用情况，包括过渡型（transitional）、原发型（naïve）、转换型记忆型（switched memory）和IgM记忆B细胞（IgM memory B cells），发现与正常B细胞相比，IGHV3-7和IGHV4-34在LPL/WM中显著过度表达(P< 0.05)；此外与过渡型、原发型和转换型记忆B细胞相比，IGHV3-74在LPL/WM中显著过度表达(P< 0.001)。有趣的是据报道，与其他三个正常B亚群相比，IGHV3-23、IGHV3-7和IGHV3-74基因在IgM记忆细胞中显著过度表达。而且，IGHV3的使用频率在IgM记忆细胞中最高。因此，与正常B细胞的其他阶段相比，LPL/WM细胞具有更接近IgM记忆细胞的谱系（图1 C）。LPL/WM患者IGHV重排偏态反映了不同类型外源性抗原诱导的发育抗原选择。

134例患者检测了DH基因使用情况。在IGHD家族中，IGHD3是最常见的亚组(45/134，33.6%)，其次是IGHD6 (30/134，22.4%)和IGHD2 (23/134，17.2%)。根据IGHD分析，最常表达的片段为IGHD3-10 (21/134，15.7%)，其次为IGHD6-13 (18/134，13.4%)（图2A）。136例患者检测了JH，发生重排中超过一半(70/136；51.5%)选择了IGHJ4片段，其次是IGHJ6 (23/136；16.9%)和IGHJ5 (21/136；15.4%)（图2B）。

此外研究确定了LPL/WM特定IGHV和IGHD基因之间的偏倚。IGHV3-30和IGHV3-74片段的患者倾向于使用IGHD6-13 (3/10；30.0%)和IGHD3-10 (3/10；30.0%)，而IGHV4-34片段患者倾向于使用IGHD6-13片段(4/14；28.6%)。IGHV3-23与IGHD2-2基因使用相关(3/20；15.0%)，但IGHV3-7片段未发现此倾向性（图2 C）。

研究还同时鉴定了IGHV和IGHJ基因的不同组合。在5个优势片段中，使用IGHV3-74和IGHV3-23的重排倾向于与IGHJ4的重组，百分比分别为70.0% (7/10)和65.0% (13/20)。此外，IGHV4-34片段伴随的IGHJ4 (4/14；28.6%)、IGHJ1 (3/14，21.4%)、IGHJ5 (3/14，21.4%)和IGHJ6 (3/14，21.4%)的频率大致相同（图2D）。

体细胞超突变分析

132例(97.1%)患者定义为伴IGHV突变基因。5个主要使用IGHV基因的体细胞超突变率（SHM）无统计学差异（IGHV3-23、IGHV4-34、IGHV3-30、IGHV3-7和IGHV3-74的中位数分别为92.5%、94.3%、93.9%、92.4%和92.0%）。作者根据IGHV高突变率将队列中的所有患者分为4组：未突变(< 2%，n = 4)、低突变(2-4.9%，n = 32)、中突变(5.0-9.9%，n = 81)和高突变(≥10.0%，n = 19)，并探索了不同IGHV基因谱系中种系同一性亚组的分布；发现IGHV3-23在中突变亚组中过度表达，而IGHV4-34组中低突变重排比例较高(P < 0.05)（图3A）。

CDR3分析

诊断时136个序列中VH CDR3区的中位长度为14个氨基酸，VH CDR3长度与突变频率负相关（r=-0.21，P= 0.016，图3B）。突变较少的IGHV基因倾向于与较长的CDR3长度相关,IGHV突变亚组间VH CDR3长度分布差异有统计学意义。在5个主要片段中，IGHV3-30的VH CDR3长度长于其他亚组（平均长度分别为16.8和13.9个氨基酸，P< 0.05，图3 C）。使用IGHV3-30的患者的CDR3显著长于使用IGHV3-23的患者(P< 0.01)（图3D）。IGHV4-34、IGHV3-7和IGHV3-74亚组的平均长度无统计学差异。

细胞遗传学异常

124/136例(91.2%)患者在诊断时进行了常规细胞遗传学检查，106例有丝分裂期合格(> 10)，其中28例患者(28/106，26.4%)有细胞遗传学异常。使用IGHV3-7片段的患者异常核型比例高于使用其他IGHV片段的患者（21.4% vs. 2.5%，P= 0.004，图4A）。28例细胞遗传学异常病例均为IGHV突变，其中6q缺失是LPL/WM中最常见的异常(8/28，28.6%)。值得注意的是，6q缺失患者的特征是IGHV3-7基因使用更频繁（37.5% vs. 4.3%，P< 0.001，图4B）。在7例患者(7/28，25.0%)中检测到至少有3个染色体畸变的复杂核型，而核型复杂性与CDR3长度之间无显著相关性(P= 0.881)。值得注意的是，8例IGHV3-7基因患者中有6例(75.0%)核型异常，6例患者中有3例检测到复杂核型。

MYD88 L265P突变

MYD88是LPL/WM患者中常见突变，因此作者对120例患者进行MYD88 L265P突变检测，。120例患者中105例(87.5%)有MYD88突变。MYD88 L265P突变患者的IGHV SHM率高于MYD88野生型患者（平均率7.3% vs. 5.8%，P= 0.050，图5A）。野生型MYD88患者的CDR3氨基酸长度明显长于MYD88 L265P患者（平均长度17.5 vs. 14.6，P= 0.008，图5B）。作者检测上述5个主要的IGHV片段，发现IGHV3-23和IGHV3-74片段在突变的MYD88 LPL/WM患者中更多(26.7% vs. 0.0%，P = 0.050)。此外，与突变MYD88患者相比，MYD88野生型患者中IGHV3-7的出现频率更高(26.7% vs. 6.7%，P = 0.042)。IGHV3-23、IGHV3-74和IGHV3-7患者突变率高。

临床相关性

所有患者的中位随访时间为26.6个月，大多数接受治疗的患者接受含硼替佐米或含利妥昔单抗的治疗(91/124，73.4%)。

作者探索了IGHV基因使用情况与临床结局之间的相关性,首先评估了具有不同IGHV基因的患者是否具有不同的临床特征。

IGHV3和IGHV4是最常见的基因重排，占85%，因此作者研究了IGHV3和IGHV4基因患者的临床特征。IGHV3片段通常与中重度贫血（62.5% vs. 37.5%，P= 0.039）和低白蛋白血症（66.3% vs 33.7%，P = 0.007）相关。在IGHV4片段患者中更常观察到血清LDH水平升高(27.3% vs. 11.1%，P = 0.050)，尤其是IGHV4-34片段患者(50.0% vs. 11.0%，P= 0.001)。

IGHV4与不良结局相关（中位PFS 14.4 vs. 25.7个月，图6A，P= 0.044），使用IGHV4的患者的3年PFS率低于未使用IGHV4的患者(46.3% vs. 73.3%)。但两组在OS方面无统计学差异（中位OS 23.0 vs. 29.1个月，P= 0.101）（图6B）。

总结

通过迄今为止最大样本量的研究，作者揭示了LPL/WM患者IGH基因使用（gene usage）、特定突变状态和VH CDR3长度的不同模式，发现IGHV片段的使用与细胞遗传学改变和MYD88突变的存在相关。此外，IGHV4节段的使用是LPL/WM的潜在预后风险因素。本研究的发现为特定IGH基因谱系可能促进或选择基因病变，并对LPL/WM的临床结局产生影响的概念提供了证据。

参考文献

Jun Wang,et al.The landscape of immunoglobulin heavy chain gene repertoire and its clinical relevance in LPL/WM.Blood Adv . 2022 May 10;bloodadvances.2022007279. doi: 10.1182/bloodadvances.2022007279.