快报｜新型CXCL10 mRNA释放试验（IP-10.TB）对结核分枝杆菌感染诊断效能的多中心临床评价研究

Diagnostic Performance of a Novel CXCL10 mRNA Release Assay for Mycobacterium tuberculosis Infection

Pan L, Huang M, Jia H, Deng G, Chen Y, Wei R, Zhang M, Li X, Sun Q, Fang M, Ren P, Xing A, Chen Q, Li X, Du B, Chen T, Gao M, Zhang Z.

Front Microbiol, 2022, 13: 825413.

doi: 10.3389/fmicb.2022.825413.

PMID: 35432271.

研究背景

结核病是严重威胁人类健康的传染性疾病。根据《2021年全球结核病报告》，全球2020年预估990万例新发结核病患者，因结核病死亡的例数达到了150万。此外，全球约1/4的人口感染了结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）。如果在结核病诊断、治疗和预防方法方面不能有所创新，那么在当前活动性结核病和结核分枝杆菌潜伏感染的双重压力下，世界卫生组织提出的“2035年终结结核病”目标将难以实现。

为了降低活动性结核病的发病率，世界卫生组织建议对结核分枝杆菌潜伏感染者进行预防性治疗。治疗的前提是要精确诊断，目前用于结核分枝杆菌感染的诊断方法，主要是结核菌素皮肤试验或γ-干扰素释放试验（IGRAs）。结核菌素皮肤试验是一种皮下测试，在接种卡介苗的人群中，结核菌素皮肤试验的特异性严重下降。尽管γ-干扰素释放试验能够避免卡介苗接种的影响，但在免疫低下的患者中，包括HIV感染、白细胞减少或使用皮质类固醇和免疫抑制剂药物治疗的患者等，γ-干扰素释放试验的诊断效能下降，表现为敏感度较低、不确定比例较高。此外，γ-干扰素释放试验尚存在一些技术缺陷，包括抗原刺激时间较长（16～24 h）、隔日报告结果、人工操作繁琐、技术水平要求高，以及易引入操作性误差等。因此，探索以其他生物标识物为靶标的新型结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测技术、缩短检测时间、简化操作流程，可能更适用于临床实践。

在活动性结核病早期诊断性标识物的研究中，发现结核病患者外周血中存在一种高表达的细胞因子，即干扰素诱导蛋白-10（interferon gamma-induced protein 10, IP-10），在特异性结核抗原刺激下表达量明显高于γ-干扰素（IFN-γ）。荟萃分析提示，IP-10蛋白诊断结核分枝杆菌潜伏感染的敏感度和特异度分别为86%和88%。研究发现，IP-10转录水平（CXCL10 mRNA）的表达量在结核抗原刺激后的2.5～8.0 h内能够上调百倍左右，这可能有助于提高其诊断敏感性。

本研究旨在评估新型结核分枝杆菌特异性CXCL10 mRNA释放试验对结核分枝杆菌感染的诊断性能，并分析新型CXCL10 mRNA释放试验与临床广泛应用的T-SPOT.TB检测的一致性。

研究对象·

2018年3月至2019年11月，首都医科大学附属北京胸科医院、深圳市第三人民医院和河南省传染病医院同时、连续性、前瞻性纳入疑似结核病患者，并募集同期结核分枝杆菌低感染风险的健康人群。本研究通过首都医科大学附属北京胸科医院伦理委员会批准，批件号为（2018）年临审第（2017-40-01）和（2019）年临审第（2017-40-02），患者入组前均签署知情同意书。

入组标准：（1）确诊结核病组：参照《WS 288—2017肺结核诊断》标准，具有结核病临床表现和具有结核分枝杆菌病原学诊断依据的患者。（2）临床诊断结核病组：参照《WS 288—2017肺结核诊断》标准，具有结核病临床表现和影像学表现但排除肺部其他疾病的患者。（3）非结核病组：主要指肺炎、肺癌、非结核分枝杆菌病等易混淆疾病，均按相应疾病的诊断标准进行诊断，并经临床诊断及鉴别诊断最终确诊。（4）结核分枝杆菌低感染风险的健康人群：指无结核病临床表现、影像学检查正常、结核菌素试验阴性（平均硬结直径或红肿≤5 mm）的参与者。

研究方法

1. 采血：采集所有疑似结核病患者和结核分枝杆菌低感染风险人群肝素抗凝静脉血10 ml，用于IP-10.TB和T-SPOT.TB检测。

2. IP-10.TB检测：采用IP-10.TB试剂盒（苏州创澜生物科技有限公司）并严格按照试剂盒说明书进行。将肝素抗凝静脉血均匀分至空白对照管（N管）、结核抗原管（T管）和阳性抗原管（P管），每管1.5 ml，立即轻柔上下颠倒混匀3～5次，使血液充分与管内壁接触，然后转入37 ℃恒温培养箱内孵育培养4 h。孵育后的全血标本在全自动核酸检测反应体系构建系统上完成外周血标本的RNA提取并逆转录成cDNA（仪器全自动操作，苏州创澜生物科技有限公司，Innovo-100）。取10 μl cDNA，15 μl聚合酶链式反应缓冲液（包含探针、酶和缓冲液），组成25 μl扩增体系，按照50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循环40次，完成实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR），qPCR检测在7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）上完成。软件自动计算靶标IP-10和内参基因（CHMP2A）的扩增循环阈值（cycle threshold, Ct），采用ΔCT=Ct靶标基因-Ct内参基因的方法分别计算N管、T管和P管中靶标IP-10的相对表达量（简称“N管值、T管值和P管值”）。

结果判读标准：将T管值—N管值≤－1.04定义为阳性结果；将T管值—N管值＞－1.04，且P管值—N管值≤－1.2定义为阴性；将T管值—N管值＞－1.04，且P管值—N管值＞－1.2定义为不确定结果。

3. T-SPOT.TB检测：采用T-SPOT.TB试剂盒（英国Oxford Immunotec公司）并严格按照试剂盒说明书进行。肝素抗凝静脉血5 ml，经淋巴细胞分离液分离得到PBMC并制备成浓度为2.5×106/ml的细胞悬液。每份测试样本需要4个检测孔：即细胞培养液作为阴性对照、植物血凝素PHA作为阳性对照、特异性抗原ESAT-6和CFP-10作为刺激抗原，每孔加入含2.5×105个细胞的细胞悬液，将微孔板放入含有5%CO2的培养箱中培养。第2天洗板后加入生物素标记的二抗于2～8 ℃反应1 h，洗板后加入显色底物液室温静置7 min，去离子水终止反应，观察结果，应用酶联斑点分析仪（CTL公司）计数着色的斑点，并按照说明书的判读标准进行结果判定。

统计学处理

应用SPSS 21.0软件进行数据的统计学分析。定量资料采用“中位数（范围）”描述，定量资料的组间比较采用t检验或Mann-Whitney U test。组间样本率的比较采用χ2检验或Fisher’s精确概率法检验。受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve, ROC）计算两种检测方法的诊断价值。两种检测方法的一致性分析采用kappa检验。两种检测方法获得的IP-10 mRNA的相对表达量和释放IFN-γ的斑点形成细胞（spot forming cell, SFC）数量的相关性分析采用Pearson检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

研究结果

1. 研究人群特征：本研究共纳入1307例疑似结核病患者，根据诊断标准，最终纳入352例具有病原学诊断依据的结核病患者和153名结核分枝杆菌感染低风险的健康者进行分析，其中14例结核病患者合并HIV感染，健康人群中无HIV感染者；其他441例临床诊断结核病患者、348例非结核疾病患者以及166例诊断不明患者未纳入分析。

2. 两种检测方法的不确定结果：在纳入最终分析的505份样本中，CXCL10 mRNA释放试验共检出2例（0.39%）不确定结果，主要原因是阳性对照管中靶标IP-10的相对表达量低于设定的阈值；而T-SPOT.TB检测共检出7例（1.39%）不确定结果，主要原因是空白对照孔的斑点数高于设定的阈值，或者是阳性对照孔的斑点数低于设定的阈值。T-SPOT.TB检测的不确定性结果的比例高于CXCL10 mRNA释放试验，但差异无统计学意义（P = 0.094）。与呈现有效检测结果的样本相比，呈现不确定结果样本中的HIV共感染比例明显升高[3/9 vs. 2.22%（11/496），P=0.0013]。

3. 两种检测方法的一致性分析：在496份有效检测样本中分析CXCL10 mRNA释放试验和T-SPOT.TB检测的一致性。两种检测方法的阳性符合率（95%CI）为96.3%（94.2%～98.3%），阴性符合率为92.4%（88.5 %～96.4%），总符合率为95.0%（93.0%～96.9%），一致性检验的kappa值为0.89（0.84～0.93，P＜0.001）。我们同时也分析了CXCL10 mRNA释放试验中靶标CXCL10 mRNA水平的相对表达量与T-SPOT.TB检测中SFC数量的相关性。两种检测方法中，CXCL10 mRNA相对表达量和IFN-γ斑点数存在正相关（r = 0.6761, P＜0.001）。

4. 两种检测方法的诊断效能：在352例确诊结核病患者和153名结核分枝杆菌感染低风险的健康人群中计算两种检测方法用于结核分枝杆菌感染的诊断效能。CXCL10 mRNA释放试验的诊断敏感度（95%CI）和特异度（95%CI）分别为93.9%（90.8%～96.2%）和98.0%（94.3%～99.6%）；T-SPOT.TB检测的诊断敏感度和特异度分别为94.5%（91.5%～96.6%）和100%（97.6%～100.0%）。CXCL10 mRNA释放试验和T-SPOT.TB检测的诊断敏感度和特异度的差异均无统计学意义（P=0.745、0.247）。我们同时分析了综合CXCL10 mRNA释放试验和T-SPOT.TB检测结果用于诊断结核分枝杆菌感染的效能，以CXCL10 mRNA释放试验和T-SPOT.TB检测同时阴性作为阴性检测结果，以任意检测阳性作为阳性检测结果，此时具有较好的阴性预测值[94.3%（89.7%～96.9%）]。

5. 两种检测方法在合并HIV感染的结核病患者中结核分枝杆菌感染的检出率：不论是CXCL10 mRNA释放试验还是T-SPOT.TB检测，都是依赖于机体对结核特异抗原的应答反应。合并HIV感染一直是γ-干扰素释放试验不确定结果或诊断敏感度降低的重要危险因素。本文中作者同时评估了CXCL10 mRNA释放试验和T-SPOT.TB检测在合并HIV感染者中结核分枝杆菌感染的检出率，结果提示：在14例合并HIV感染的结核病患者中，CXCL10 mRNA释放试验的检出率（95%CI）为92.9%（66.1%～99.8%），而T-SPOT.TB的检出率仅为61.5%（31.6%～86.1%），差异有统计学意义（P= 0.029）。

研究意义和展望

在继往关于结核分枝杆菌感染和结核病诊断特异性标识的研究中，已经发现IP-10蛋白以及编码该蛋白的CXCL10 mRNA的重要意义，也有研究证实在结核特异抗原刺激后的短时间内会发生CXCL10 mRNA表达量的急速上升。但国内外尚缺乏以CXCL10 mRNA为靶标的检测试剂，也缺乏针对这一靶标用于结核分枝杆菌感染诊断的多中心评估数据。本研究平行地比较了以CXCL10 mRNA为靶标的新型结核感染T细胞检测技术和临床应用最广泛的T-SPOT.TB检测在结核分枝杆菌感染诊断中的效能，结果提示CXCL10 mRNA释放试验具有与T-SPOT.TB相媲美的诊断敏感度和特异度，而且在合并HIV感染的结核病患者中具有更高的阳性检出率。

包括合并HIV感染在内的免疫功能异常的人群是结核分枝杆菌感染的易感人群，也是发展为活动性结核病的高危人群。尽管应用γ-干扰素释放试验筛查该类人群结核感染并指导预防性治疗已成为临床共识，但研究表明在免疫功能异常人群中γ-干扰素释放试验的检测效能显著降低，严重影响临床应用。本研究数据显示，以CXCL10 mRNA作为检测靶标，能够降低不确定结果的发生率，并明显提高合并HIV感染人群结核分枝杆菌感染的检出率，这对于开展免疫异常人群结核感染筛查和预防性治疗具有重要价值。因此，研究认为CXCL10 mRNA释放试验在结核分枝杆菌感染诊断方面具有较好的检测效能，具备临床推广应用的价值和前景。

注：除非特别声明，本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社观点。

译稿：潘丽萍

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布时间：2022-05-11