快报｜外周血microRNA鉴别结核潜伏感染者中发病高危人群的能力

近日，Microbiol Spectr杂志发表了一项外周血microRNA表达水平与结核潜伏感染者中活动性肺结核发生风险的关联性研究（Xin H, Cao X, Du Y, et al. The Association between Circulating microRNAs and the Risk of Active Disease Development from Latent Tuberculosis Infection: a Nested Case-Control Study. Microbiol Spectr, 2022 Apr 18: e0262521. doi: 10.1128/spectrum.02625-21.）。该研究主要由中国医学科学院病原生物学研究所完成；通过巢式病例对照设计，回顾性检测潜伏感染人群中的发病者和未发病者基线外周血microRNA的表达水平，评价其作为预测标识鉴别潜伏感染者中的发病高危人群的能力。中国医学科学院病原生物学研究所副研究员辛赫男，博士生曹雪芳、杜莹，中牟县疾病预防控制中心检验科主任闫娇霞为文章第一作者，中国医学科学院病原生物学研究所高磊研究员与中牟县疾病预防控制中心主任潘守国为文章的通讯作者。

研究背景

针对结核潜伏感染（LTBI）高危人群开展预防性治疗是降低结核病发病率的直接手段，也是实现END TB全球战略目标的重要组成部分。我国是结核潜伏感染高负担国家，准确界定发病高危人群是实现精准干预面临的重要挑战。探索可以准确预测疾病发生风险的生物标志物将为精准干预策略的制定提供新的思路和依据。MicroRNAs (miRNA) 通过作用编码蛋白的mRNA在调控基因表达方面发挥着重要作用。在结核病研究领域，关于外周血miRNA作为结核病诊断标识的报道屡见不鲜。但大多数研究采用横断面研究设计且样本量有限，鲜有前瞻性设计的报道。在此背景下，研究团队基于前期开展的一项多中心前瞻性队列研究，该研究对基线γ干扰素释放试验（IGRA）阳性或结核菌素皮肤试验（TST）阳性（≥10mm）的人群进行了5年随访，追踪其发病情况。基于该队列，本研究利用巢式病例对照设计，回顾性检测和比较潜伏感染者中发展为活动性结核病的调查对象（TB组）和未发病的调查对象（LTBI对照组）之间的基线miRNA表达水平，评价其作为预测标识鉴别潜伏感染者中发病高危人群的能力。

研究方法

1、研究设计和人群：本研究依托国家“十二五”传染病科技重大专项子课题“结核分枝杆菌感染的流行病学调查和队列研究”所建立的潜伏感染队列。2013年，研究团队针对2.2万名5岁以上农村常住人口同时采用IGRA及TST开展结核感染检测，对其中7505例感染检测阳性者（IGRA阳性或TST≥10mm）建立感染队列，通过5年随访追踪其发病情况。最终，共确诊117例活动性肺结核患者，随机选择20例发生活动性结核病的调查对象作为病例组，并通过年龄、性别匹配20例未发生活动性肺结核者作为对照组，利用Agilent MicroRNA芯片技术对其基线时的miRNA表达水平进行检测，对差异表达的miRNA在更大样本人群中（73例TB组和77例性别、年龄、研究现场匹配的LTBI对照组)进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证。

2、差异miRNA筛选及验证：收集每例调查对象基线检测时的血液样本，提取总RNA。利用Agilent MicroRNA芯片技术对2549个人类miRNA进行检测。芯片原始数据经过归一化后，转换为以2为底的对数值（log2），差异表达倍数（Fold-change）为两组之间的log2比值。两组间Fold-change≥2或≤0.5，P<0.05表明差异有统计学意义。

对差异表达的miRNA利用RT-qPCR进一步验证。首先，对150例样本提取RNA，质检合格后（RNA总量>120 ng），进行后续RT-qPCR检测。本研究使用cel-39作为RT-qPCR的内参，每个基因、样本重复检测3次，取3次检测平均CT值作为最终CT值。使用ΔΔCt法计算候选miRNA的相对表达量。

研究结果

1、研究对象的特征：随机选择20例TB组和20例对照组进行miRNA芯片检测，共检测了基线2549种miRNA的表达水平。两组基本人口学特征方面，与对照组相比，除TB组有既往结核病病史的比例更高外，其他因素在两组间分布均衡。

2、miRNA芯片筛选结果：共发现6个差异表达的miRNA，其中，hsa-miR-197-5p、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-6760-3p、hsa-miR-642a-3p在TB组的表达水平明显高于对照组，而hsa-miR-16-5p和hsa-miR-451a在TB组的表达水平明显低于对照组。

3、差异表达miRNA的RT-qPCR验证结果：利用RT-qPCR进一步验证差异表达的miRNA。73例TB组和77例LTBI组基本人口学特征分布显示，有既往结核病病史者及低体质量者发生活动性肺结核的风险更高。RT-qPCR验证结果显示，hsa-miR-197-5p和hsa-miR-6760-3p的表达水平在两组间差异无统计学意义，hsa-miR-671-5p在两组间的相对表达水平与芯片结果相反。hsa-miR-16-5p和hsa-miR-451a在LTBI组中的表达水平明显高于TB组，且在两组间的相对表达水平与芯片结果一致。

4、候选miRNA预测活动性结核病发病的能力：利用ROC曲线下面积和PRC曲线下面积评价hsa-miR-16-5p、hsa-miR-451a及其他与肺结核发生相关的协变量预测结核病发生能力的表现。BMI、既往结核病病史、hsa-miR-16- 5p和hsa-miR-451a的ROC曲线下面积分别为0.66（95%CI：0.58～0.73）、0.71（95%CI：0.63～0.78）、0.66（95%CI：0.58～0.74）和 0.68（95%CI：0.60～0.76）；PRC曲线下面积分别为0.65（95%CI：0.55～0.74）、0.77（95%CI：0.71～0.83）、0.63（95%CI：0.52～0.71）和0.67（95%CI：0.57～0.76）。联合协变量（既往结核病病史和BMI）后，hsa-miR-16-5p的ROC曲线下面积和PRC曲线下面积为0.84（95%CI：0.77～0.89）和0.86（95%CI：0.79～0.90）；hsa-miR-451a的ROC曲线下面积和PRC曲线下面积为0.85（95%CI：0.79～0.90）和0.87 (95%CI：0.81～0.91)。控制两个协变量的影响后，hsa-miR-16-5p和hsa-miR-451a调整后ROC曲线下面积分别为0.68和0.78。

单独miRNA和不同变量组合下预测能力方面，hsa-miR-451a的特异度最高，为90.91%（95%CI：82.40%～95.53%），但敏感度最低，为38.36%（95%CI：28.05%～49.83%）。hsa-miR-451a联合BMI和既往结核病病史表现出最佳的预测能力，敏感度为80.82%（95%CI：70.34%～88.22%），特异度为79.22%（95%CI：68.88%～86.78%）。

研究结论

本研究通过前瞻性研究设计，分析比较了TB组和LTBI组基线miRNA的表达水平，结果显示在潜伏感染人群中，外周血hsa-miR-451a和hsa-miR-16-5p的低表达可能与未来活动性肺结核的发生有关。联合其他协变量后，两者均表现出不错的预测能力（AUC分别为0.84和0.85）。校正其他协变量后，hsa-miR-451a仍表现出不错的预测能力（AUC为0.78），为通过分子标识探索潜伏感染发病高危人群的精准识别提供了更多研究思路。上述研究结果需要在不同特征人群中进行进一步验证。

编辑：李敬文

校对：郭    萌

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