CRISPR/Cas9基因编辑在心血管疾病研究中的应用进展

吴超 何淑芳

安徽医科大学第二附属医院麻醉与围术期医学科，麻醉与围术期医学安徽普通高校重点实验室（安徽医科大学），合肥 230601

国际麻醉学与复苏杂志,2022,43(3):322-326

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20210204‑00511

 基金项目 

安徽高校自然科学研究项目（KJ2020A0212）；

安徽医科大学第二附属医院国家自然科学基金孵育计划（2019GMFY01）；

安徽医科大学科研平台基地建设提升计划项目（2020xkjT060）

REVIEW ARTICLES

【综述】

在全球范围内，心血管疾病的流行率在不断上升，且心血管疾病是导致非传染性疾病死亡的主要原因 。以往基于常见心血管疾病（如先天性心脏病、冠心病、心律失常、心力衰竭、心肌病等）的治疗主要还是药物治疗和手术治疗。

20世纪80年代末有研究者就预测基因疗法将会成为疾病治疗的一种方法，而基因治疗确实已经成为疾病治疗的未来之路 。在心血管领域，基因编辑为预防或治疗心血管疾病提供了一种全新的方法，因为只需一次应用，它就可以永久地改变目标基因的表达，从而可能收获终生治疗效益 。

成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR‑associated protein 9, CRISPR/Cas9）基因编辑技术相较以往的锌指核糖核酸酶和类转录激活因子效应物核酸酶技术有极大的本质提升，从2007年开始研究该技术到2013年一篇关于通过Cas9蛋白携带一个具有靶向特异性的RNA引导Cas9蛋白到特定的靶点上进行切割的文章，彻底改变了基因组编辑领域 。

由于实现了DNA的精确编辑，CRISPR/Cas9基因编辑技术广泛应用于生物学领域。

1 CRISPR/Cas9基因编辑技术

CRISPR/Cas9基因编辑技术即成簇规律间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白系统，是由RNA介导的细菌和古细菌的免疫防御系统，降解入侵遗传物质 。该系统有三种类型：TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ。其中TypeⅠ、TypeⅢ有着共同点：特定的Cas内切酶处理前体CRISPR RNA（Pre‑crRNAs）成熟后形成多Cas蛋白复合物，识别和切割与crRNA互补的核酸。

TypeⅡ处理Pre‑crRNA的机制不同，Pre‑crRNA通过重复序列与其互补序列反式激活crRNA （trans‑activating CRISPR RNA, tracrRNA）反式结合，然后在Cas9存在的情况下被RNaseⅢ加工融合成一个单链向导RNA（single guide RNA, sgRNA）。

CRISPR/Cas9基因编辑技术属于TypeⅡ，由Cas9核酸酶、编码向导RNA的CRISPR RNA（crRNA）序列和协助crRNA识别特异位点的tracrRNA三部分组成。为了使CRISPR/Cas9基因编辑技术更加高效，Cong等 和Ran等 进行了优化和改进，将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。这样CRISPR/Cas9仅包含两个元素：Cas9蛋白和sgRNA。

Cas9是唯一负责crRNA引导的外源DNA沉默的蛋白质，其首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过前间区序列邻近基序结合并侵入DNA，形成RNA‑DNA复合物，进而切割目的DNA，使DNA双链断裂，产生特异性DNA双链断裂（double strand break, DSB）。DSB形成之后，会被一条或两条主要的修复路径修复：同源定向修复（homology‑directed repair, HDR）和非同源末端连接（nonhomologous end joining, NHEJ），NHEJ很容易出错，所以可在DSB形成后，向细胞内导入靶位点的同源序列作为修复模板，则会进行HDR，实现基因的精确编辑 。

2 CRISPR/Cas9基因编辑技术在预防治疗心血管疾病中的研究应用

近年来，随着单基因突变疾病和复杂疾病研究的进展，越来越多的证据表明了常见变异在疾病易感性中的作用，这使得基因编辑方法能够用于像心血管疾病这样的复杂疾病的预防和治疗。CRISPR/Cas9基因编辑技术既可以用于纠正疾病相关突变，还可以通过导入保护性突变和靶向病毒基因组来达到治疗目的。因此，合理科学地运用CRISPR/Cas9基因编辑技术来研究探讨基因治疗将极大地帮助临床心血管疾病患者。

2.1　在冠心病高风险因素中的应用研究

冠心病是由冠状动脉粥样硬化引起冠状动脉供血不足的一类器质性心脏病，发病因素很多，但是血液中高水平的低密度脂蛋白胆固醇是冠心病的主要危险因素，因为低密度脂蛋白胆固醇可以在血管壁的细胞中积聚，推动动脉粥样硬化的进展 。

早已有研究表明前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/ kexin 9型丝氨酸蛋白酶（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9）序列功能缺失突变可大幅降低低密度脂蛋白胆固醇水平和冠心病风险，而这不会有任何的临床副作用，因此奠定了一种针对PCSK9治疗冠心病的安全有效方法的基础。随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用，有研究者运用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功将编辑过的PCSK9在肝人化小鼠模型中高效表达，导致血浆PCSK9水平显著降低（>50%）及血胆固醇降低40%，同时由于体内PCSK9靶向在人肝细胞中有效，这表明靶向PCSK9的基因组编辑疗法在人类中同样有效 。此外，一种新的策略称为三重靶向策略，使用纳米载体递送的CRISPR/Cas9基因编辑技术来导致PCSK9的功能缺失突变，具有约60%的体外PCSK9编辑效率 。

众所周知，家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia, FH）可导致动脉粥样硬化，患者具有较高的终生心血管疾病风险 。近期，从1例低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor, LDLR）缺失型FH患者中获得诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC），在CRISPR/Cas9基因编辑技术介导下对FH‑iPSC进行基因校正，从而恢复了LDLR的表达和功能，为治疗FH提供了模型 。随后，通过腺相关病毒携带的CRISPR/Cas9基因编辑技术纠正LDLR基因，有效改善了LDLR突变的动脉粥样硬化表型，为FH及相关心血管疾病提供了一种潜在治疗途径 。

未来如能在冠心病各个风险因素层面上实现基因水平的调控，那将是冠心病治疗和预防的新时代。

2.2　在先天性心脏病中的应用研究

先天性心脏病是最常见的出生缺陷类型之一，指在胚胎发育时期心脏或大血管形成障碍或发育异常引起的解剖结构异常，或出生后自动关闭的通道未能闭合（在胎儿期属正常）的情形。至今为止，对于先天性心脏病的治疗主要依赖介入、手术和药物，但是临床上对很多复杂先天性心脏病以及病情严重的患者往往束手无策。

然而随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的推广，利用该技术在非洲爪蟾动物模型中快速有效地筛选和验证了先天畸形患者数百个候选基因。随后CRISPR/Cas9基因编辑技术被证明可以纠正出生后或成年小鼠的遗传缺陷，有研究者就将人iPSC与CRISPR/Cas9基因编辑技术相结合，在体外产生与GATA4基因突变相关的先天性心脏病模型来探讨该基因突变所导致发病机制 。

另有研究表明，心内膜中Notch信号通路的突变会导致新生儿先天性心脏病，近期利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进一步证实microRNA‑34a通过调节Notch信号通路下调Noch‑1，从而增加先天性心脏病的风险 。基于这些动物实验，有研究报道了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术通过对心脏左右发育不对称基因（DAND5）的c.455G>5突变进行纯合子校正，建立了先天性心脏畸形患者的人类iPSC系 。

随着基因编辑技术不断发展，这种新的治疗方法将来也许会给先天性心脏病患者带来福音。

2.3　在心肌病中的应用研究

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经用于纠正缺失的致病DNA突变而导致的大蛋白功能改变，并且已经尝试用于治疗Duchenne 型肌营养不良症（duchenne muscular dystrophy, DMD）。由于引起DMD的基因突变发生在心肌细胞会导致心肌病，一项研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术删除iPSC中的外显子3~9，从而特别有效地纠正了DMD基因ABD‑1区域的突变 ，这为最终纠正DMD基因进而治疗DMD和心肌病迈出了重要一步。

肥厚性心肌病（hypertrophic cardiomyopathy, HCM）是非常普遍的一种心肌病，而目前针对HCM的治疗多以药物为主，目的只是减缓病情进展。已有研究表明，谷胱甘肽硫转移酶K1下调是HCM的发病机制，但是具体详细机制尚不清楚。最近的研究报道显示，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，研究者成功建立了HCM模型，从而对HCM进行了基因校正 。

目前基因编辑技术的应用不仅促进了我们对心肌病的了解，而且促进了治疗方法的发展 。我们相信，随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的不断发展，基因治疗心肌病有可能彻底解决心肌病致病基因突变问题，并防止向后代遗传。

2.4　在心力衰竭方面的研究应用

心力衰竭是以进行性心脏重构和功能障碍为特征的复杂综合征。尽管诸如血管紧张素转换酶受体拮抗剂、β受体阻滞剂等药物治疗已经取得了一定的进展，但是心力衰竭的发病率仍然很高，因此需要更加新颖和有效的治疗方法。PRKAG2心脏综合征的患者通常会发展为室性心动过速并进展为难以治疗的进行性心力衰竭。

该病由编码AMP激活蛋白激酶γ2调节亚基的PRKAG2基因突变引起。有研究已经从家族性Wolff‑Parkinson‑White综合征患者中发现了PRKAG2的H530R突变，并用小鼠建模证实了H530R突变与PRKAG2心脏综合征的因果关系，同时进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术与腺相关病毒‑9结合破坏H530R的突变型PRKAG2等位基因。

结果表明，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术选择性干扰致病突变是治疗PRKAG2心脏综合征的有效方法 。几乎在同一时间，Kaneko等 在钙调素过度表达引起的心力衰竭小鼠模型中，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除磷蛋白基因显著地改善了心功能。

2.5　在遗传性心律失常中的研究应用

心律失常是心血管疾病中重要的一组疾病，可单独发病也可和其他心血管疾病伴发，严重威胁人类健康。其中遗传性心律失常在青少年中引起心源性猝死的风险极高，如长QT综合征（long QT syndrome, LQTS）就是最常见的遗传性心律失常，严重威胁患者生命安全 。

虽然目前已经发现了许多致病基因，但是在治疗方面仍然存在着巨大的挑战。Limpitikul等 成功地纠正了iPSC衍生的心肌细胞中钙调蛋白2基因的突变，潜在地减轻了LQTS引发的心脏不良事件。随后Yamamoto等 从1例携带CALM2‑N98S突变的患儿中分离出LQT15人类iPSC（LQT15‑hiPSC），并将其分化为心肌细胞（LQT15‑hiPSC‑CMS），然后使用CRISPR/Cas9基因编辑技术将突变的等位基因特异性敲除，并分析了电生理特性。结果显示，通过消除突变的等位基因挽救了LQT15‑hiPSC‑CMS的电生理异常 。

这就为遗传性心律失常疾病提供了一种新的治疗方法。CRISPR/Cas9基因编辑技术可以作为LQTS表型有效和安全的救治手段，但仍有实质性的挑战有待克服 。

2.6　在心肌缺血/再灌注中的研究应用

心肌缺血/再灌注与心功能不全密切相关，各种原因导致的心肌缺血/再灌注损伤给患者生命安全带来严重威胁。已有大量的研究表明线粒体损伤分裂后的心肌细胞凋亡是心肌缺血/再灌注损伤的重要信号 。

而肌球蛋白ⅡA‑肌动蛋白的相互作用在调节心肌缺血/再灌注诱导心肌细胞线粒体分裂中起至关重要的作用，Li等 在心肌缺血/再灌注模型中利用CRISPR/Cas9技术敲除了肌球蛋白ⅡA基因，阻断了缺血/再灌注诱导的细胞凋亡，抑制了人第10号染色体缺失的磷酸酶诱导激酶1（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten induced putative kinase 1, Pink1）/ Parkin通路，减少了线粒体的分裂。

通过调控Pink1/Parkin通路和线粒体分裂抑制心肌细胞凋亡和心肌缺血/再灌注损伤，可能为心血管疾病的治疗提供新的思路。

3 CRISPR/Cas9基因编辑技术在心血管疾病中应用尚存在的问题

首先，尽管CRISPR/Cas9基因编辑技术作为一种治疗手段在过去的10年里表现出了极大的吸引力，但具体的疗效取决于CRISPR/Cas9基因编辑技术在体内的成功率。而这种效率在不同的组织中差别很大，如在小鼠的心肌和骨骼肌中的效率低于在肝脏中的效率。即便在专门表达Cas9的转基因小鼠心肌细胞中，其编辑效率也不高 。

其次，基因治疗的最佳目标疾病是单突变致病，而心血管疾病大多是复杂的多基因、多因素疾病。这类疾病往往是由环境因素和遗传因素共同作用的结果，从而使得已取得的治疗手段从实验室到临床的转化产生了很多争议。更加准确地说，CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于多基因表达引起的疾病中显示出了一定的劣势，这给多基因疾病的研究带来了很多问题 。

最后，随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的快速发展，也带来了伦理安全的相关问题。对此，美国国家科学院和国家医学院组成的多学科国际委员会建议：当前的基因治疗伦理和监管标准仅应用于体细胞（非遗传）人类基因组的编辑。

4 总结和展望

CRISPR/Cas9基因编辑技术代表了基因组编辑技术的突破性进展。本文综述了CRISPR/Cas9基因编辑技术的基本原理以及在心血管领域（特别是一些常见心血管疾病）研究中的应用进展，目前在该领域的应用已经相当广泛，并且很多已取得的成就已经为心血管疾病的深入研究和开发新的治疗策略铺平了道路。期待未来CRISPR/Cas9基因编辑技术更加有效地应用于人类的健康事业。