气道微生物组和血清代谢组学分析确定过敏性鼻炎中的差异候选生物

2022
05/08

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微生态
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微生物组和代谢组学分析提供了重要的候选生物标志物,特别是微生物组中的差异属也已通过随机森林预测模型得到验证。差异微生物和差异代谢物有可能用作诊断过敏性鼻炎的生物标志物。

导读  

过敏性鼻炎(AR)是一种常见的异质性慢性疾病,发病率高,发病机制复杂,受多种因素影响,涉及遗传和环境因素的组合。为了深入了解AR的发病机制和识别诊断生物标志物,我们结合系统生物学方法来分析微生物组和血清成分。我们收集了下鼻甲拭子和血清样本,研究了28名过敏性鼻炎患者和15名健康人的微生物组和血清代谢组。我们对来自上呼吸道样本的16S rDNA基因的V3和V4区域进行了测序。代谢组学用于检查血清样品。最后,我们结合了差异微生物群和差异代谢物来寻找潜在的生物标志物。

我们发现疾病组和对照组之间的多样性没有显著差异,但微生物群的结构发生了变化。与HC组相比,AR组1门(放线菌)和7属(克雷伯氏菌、普雷沃氏菌和葡萄球菌等)的丰度显著升高,1属(Pelomonas)的丰度显著降低。血清代谢组学揭示了26种不同的代谢物(前列腺素D2、20-羟基白三烯B4和亚油酸等)和16种被破坏的代谢途径(亚油酸代谢、花生四烯酸代谢和色氨酸代谢等)。组合的呼吸微生物组和血清代谢组学数据集显示出一定程度的相关性,反映了微生物组对代谢活动的影响。我们的结果表明,微生物组和代谢组学分析提供了重要的候选生物标志物,特别是微生物组中的差异属也已通过随机森林预测模型得到验证。差异微生物和差异代谢物有可能用作诊断过敏性鼻炎的生物标志物。

论文ID

名:Airway Microbiome and Serum Metabolomics Analysis Identify Differential Candidate Biomarkers in Allergic Rhinitis

气道微生物组和血清代谢组学分析确定过敏性鼻炎中的差异候选生物标志物

期刊Frontiers in Immunology

IF:7.561  

发表时间:2022.1.5

通讯作者:王放 

通讯作者单位:吉林大学基础医学院

DOI号:10.3389/fimmu.2021.771136  

实验设计

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结果

1 所有参与者的特征

共有43名AR(n=28)和健康对照(HC)(n=15)的参与者参加了这项研究。研究队列的临床人口统计数据见表1。基本自然特征的统计数据,包括性别、年龄和BMI值,在两组之间没有显示任何显著差异。过敏性鼻炎患者的血清总IgE水平显著高于健康对照组。所有过敏性鼻炎患者均为急性发作的季节性过敏患者。

表1. 登记参与者的临床特征。 

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2 AR患者与HC上呼吸道的微生物群 2.1 测序深度的估计

43个样本的16S rDNA测序基于Ion S5TM XL测序平台。经过质量控制过滤后,每个样本平均获得79,137个有效数据。将序列聚类为同一性为97%的OTU,共得到2736个OTU,然后用Silva132对序列进行注释。在注释结果中,共有1,314个(48.03%)OTU被注释到属级别。

稀疏曲线显示每组样本到达平台阶段的曲线,表明测序数据量合理(图1A)。Rank Abundance曲线反映了每组样本的丰富度和均匀度(图1B)。物种积累箱线图显示,随着样本量的增加,物种多样性逐渐增加,曲线在43个样本量处变平(图1C)。

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图1. AR和HC组中样本深度的估计。(A)稀疏曲线。(B)排名丰度曲线。(C)物种累积箱线图。AR,过敏性鼻炎;HC,健康控制。

2.2 α-多样性和β-多样性

α-多样性用于分析群体中微生物群落的多样性。对每个样本中的Chao1、观察到的物种和Simpson指数的评估表明,与HC相比,过敏性鼻炎患者的α-多样性没有变化(图2A-C)。简而言之,没有观察到物种丰富度和多样性的显著变化。

β-多样性是对不同群体微生物群落组成的比较分析。基于欧几里得距离的主成分分析(PCA)能够提取最大化样本间差异的两个轴,从而在二维坐标图上反映多维数据的差异(图2D)。通过t检验分析的β-多样性指数显示两组之间存在显著差异(图2E)。

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图2 变应性鼻炎

(AR)组和健康对照组

(HC)微生物群的α多样性分析。

(A)Chao1指数统计。

(B)观察到的物种指数统计。

(C)Simpson指数统计。

(D)显示二维样本的主成分分析(PCA)(PC1=1 54%,PC2=10.25%)。(E)Beta多样性指数统计。学生t检验,**p<0.01。

2.3 AR患者微生物群分类组成的分布

根据物种注释结果,选取门和属水平上丰度最高的前10个物种为AR组和HC组,生成相对丰度直方图,以可视化不同分类下相对丰度较高的物种及其比例水平。在门水平,变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门是气道微生物群中最丰富的实体(图3A)。此外,Stenotrophomonas、Sphingomonas和粪杆菌在属水平上主导气道微生物群(图3B)。

ARs中放线菌门的丰度更高(p<0.05,图3C)。Klebsiella、Prevotella、Finegoldia、Vibrio在ARs中明显富集(p<0.01,图3D)。与HCs相比,AR患者中unidentified_Cyanobacteria、unidentified_Corynebacteriaceae、Delftia、葡萄球菌属较高,而HCs中的Pelomonas更丰富(p<0.05,图3D)。为了进一步研究属水平物种的系统发育关系,通过多序列比对获得了前100个属的代表性序列,如图3E所示。

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图3  AR和HC组门和属水平的分类群分布。

(A)门水平微生物组的组成。

(B)属水平的微生物组组成。

(C)前10个门的统计结果。

(D)前35个属的统计结果。

(E)由属级物种的代表性序列构建的系统发育树,分支和扇形颜色表示其对应的门,扇形环外的堆叠直方图表示不同样本中该属的丰度分布信息。

2.4 AR气道微生物谱的预测建模

随机森林是一种基于分类树算法的经典机器学习模型,为区分AR和HC组提供了进一步的支持。该分析基于基于OTU的特征构建了10属的随机森林预测模型。通过Mean Decrease Accuracy(图4A)选择了重要的属,对模型进行了10倍交叉验证,并绘制了接收者操作特征(ROC)曲线以对预测能力进行评分。曲线下面积(AUC)为0.9628(95%CI:0.906-1.000)(图4B),表明气道微生物群有可能从健康和疾病对照中诊断过敏性鼻炎患者。我们观察到模型中,变形杆菌属、短杆菌属、毛杆菌属、普氏菌属、叶状杆菌属、细小球菌属、乳杆菌属、毛单胞菌属、unidentified_Corynebacteriaceae、Candidatus_Saccharimonas 10个属,变形杆菌门5个,厚壁菌门2个,拟杆菌门1个,放线菌门1个。因此,它们可能被用作生物标志物来识别最有可能发展为AR的患者。

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图4.使用随机森林基于属级相对丰度的AR状态气道微生物群预测模型。

(A)变量重要性排名图,MeanDecreaseAccuracy衡量一个随机森林的预测准确度通过将一个变量的值改为一个随机数来降低的程度。较高的值表明该变量更重要。

(B)使用10个判别属的AR模型的ROC曲线。

3 AR与HC的代谢组学分析 3.1 代谢组学数据的多元分析

为了进一步确定过敏性鼻炎的发病机制,使用UPLC-QTOF-MS/MS进行了非靶向代谢组学。主成分分析(PCA)是一种无监督模式识别方法,可用于在搜索可能的生物标志物时选择不同的变量。图5A、B显示了ESI+和ESI-模式下血清代谢组学的PCA评分二维图。QC样品紧密聚集,这进一步表明代谢组学系统具有良好的稳定性。此外,可以观察到过敏性鼻炎组(AR)和健康对照组(HC)的明显分离,表明这两组是不同的。

潜在结构判别分析(OPLS-DA)的正交投影是一种模式识别的监督方法,能够可视化和描述AR和HC组之间的一般代谢变化。如图5C、D所示,每个样品在评分图中表示为一个点,并且AR和HC组在ESI+和ESI-模式下分开。排列测试(n=200)用于验证OPLS-DA模型。从置换图中,左侧的所有蓝色Q2值均低于右侧的原始点,表明原始模型的有效性(参见图5E、F)。

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图5. 不同组的血清代谢组学特征。

(A,B)过敏性鼻炎和健康对照组血清代谢谱的PCA评分图。

(C,D)AR和HC组血清代谢谱的OPLS-DA评分图。

(E,F)OPLS-DA模型的排列图。

3.2 血清中差异代谢物的鉴定

创建S图以识别差异代谢物(图6A、B)。S图中的不同点代表不同的变量,离原点越远,这些点对疾病组和健康组之间差异的贡献越显著。基于从上述OPLS-DA模型中提取的预测变量重要性(VIP)的贡献选择潜在差异代谢物。基于VIP>1.0、p<0.05标准筛选和质谱比较,血清中共有26种稳健的内源性代谢物被鉴定为潜在的生物标志物(在S图中以红色标记)。在与来自HMDB或METLIN数据库的每种代谢物的参考光谱进行比较后,用于鉴定的片段的详细信息如表2所示。使用26个ESI+和ESI-模式的候选生物标志物生成预测的ROC曲线,表明这些代谢物是过敏性鼻炎的潜在诊断标志物(图6C、D)。

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图6.血清中差异代谢物的鉴定。

A-B,OPLS-DA S-图基于ESI+模式(A)和ESI-模式(B)的血清样品的代谢组学分析。使用有助于AR进展的26个候选生物标志物生成的预测ROC曲线。(C)CAR>CHC;(D)CAR<CHC。

表2.血清样品中鉴定的不同代谢物。

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RT,保留时间;Mass,测量的质量。

3.3 血清中差异代谢途径的鉴定

基于已鉴定的代谢物,使用MetaboAnalyst 4.0鉴定了16条可能与AR发生相关的紊乱代谢途径,结果如图7所示。影响值代表代谢途径的重要性,-log10(P)值代表代谢途径的差异,圆圈的大小与上述两个参数呈正相关。确定的代谢途径总结在表3中。在血清样品中总共观察到三个显著改变的途径,具体而言,两个改变的代谢途径(亚油酸代谢和花生四烯酸代谢)表现出极端显著性(影响>0.1,p<0.01),剩下的一个途径(咖啡因代谢)显示出潜在的意义(影响>0.1,p<0.05)。而色氨酸代谢可能与AR的发生相关(影响>0.1,p>0.05)。

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图7. MetaboAnalyst 4.0对血清样本中的代谢途径紊乱进行了分析。

表3  不同代谢物代谢途径的结果。 

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3.4 AR中的微生物组和代谢组关联分析

使用微生物组和代谢组之间的相关性分析,我们计算了15个差异属和26个差异代谢物之间的Spearman相关性(图8)。我们发现富含AR的属与富含AR的代谢物呈正相关,但与富含HC的代谢物呈负相关。

一致地,富含HC的属与富含HC的代谢物呈正相关,但与富含AR的代谢物呈负相关,这意味着呼吸道微生物群与宿主之间高度一致的代谢相互作用。Brevundimonas、变形杆菌、Muribacter、Finegoldia和Prevotella与代谢物的关系最为显著。相比之下,乳酸杆菌和葡萄球菌几乎与差异代谢物相关。

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图8. 微生物组和代谢组的相关性分析。

Spearman的相关性分析是使用AR的潜在微生物组生物标志物和潜在代谢物生物标志物进行的。学生t检验,*p<0.05,**p<0.01。

讨论

在这项研究中,我们首先收集了AR患者和HC志愿者的鼻下鼻甲拭子,结合16S rRNA的高通量测序报告,疾病组和对照组之间的多样性、丰度和同质性没有显著差异,但微生物群结构发生了变化,与HC组相比,AR组1门和7属的水平显著升高,1属的水平显著降低。基于OTU的特点,我们构建了10个属的随机森林预测模型,并对模型进行了10倍交叉验证,表明气道微生物群具有诊断过敏性鼻炎患者的潜力,可作为候选生物标志物。然后,我们使用代谢组学分析AR患者和HC志愿者的血清,发现AR患者的系统代谢谱发生了改变,共识别出26种不同的代谢物和16种受干扰的代谢途径。多组学研究表明,上呼吸道微生物群与宿主代谢保持高度一致的作用。

微生物群在调节与特应性疾病相关的免疫反应中起着至关重要的作用。我们注意到,急性加重期AR患者的下鼻甲微生物群主要由变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门的成员组成,它们与HC相似,但不同之处在于放线菌门AR显著增加。在较低的分类水平上,AR中的克雷伯菌属、普雷沃氏菌属和葡萄球菌属显著增加,而在HC中,最普遍的属是Moraxella、Haemophilus、链球菌属和Flavobacterium,这可能是由于菌群失调引起的。炎症状态与微生物相互作用引起的微生物生态学。在正常情况下,鼻咽部的微生物群主要是变形菌(例如,Moraxella和Haemophilus)、厚壁菌门(例如,葡萄球菌和Dolosigranulum spp.)和放线菌(例如,棒状杆菌属)。AR患者上呼吸道放线菌门和克雷伯氏菌属、普雷沃氏菌属和葡萄球菌属的增加可能与过敏状态下下鼻甲增大,上皮通透性增加,使上呼吸道出现异常积液有关。气道表面和影响鼻粘膜共生菌群的平衡。

克雷伯氏菌在种群宿主中有两个主要的定殖渠道:上呼吸道和肠道。它的定植与这两个位置的微生物群和免疫系统建立的防御作斗争。已经表明,在上呼吸道,变形菌通过IL-17A增强免疫力,但克雷伯氏菌克服了这些防御,因此通过封装有效地定殖。拟杆菌足以防止克雷伯氏菌通过IL-36在宿主之间传播。葡萄球菌在过敏性鼻炎患者中很常见,尤其是金黄色葡萄球菌,其定植率为44%,而健康对照组为20%。过敏性金黄色葡萄球菌携带者的鼻部症状评分较高。Xyun等人,描述了在血清总IgE水平高的个体(高IgE组)中观察到的微生物多样性较低,与总IgE水平低的个体(低IgE组)相比,金黄色葡萄球菌的相对丰度较高。金黄色葡萄球菌诱导IgE产生并促进过敏性炎症。高IgE水平会导致金黄色葡萄球菌大量繁殖,从而激活肥大细胞脱粒并导致炎症。因此,控制金黄色葡萄球菌和IgE水平可能是预防包括AR在内的IgE相关疾病的有效策略。普氏菌属是人类口腔中第二丰富的属,并且无论何时存在,它基本上都是肠道微生物群中最丰富的。Prevotella与饮食之间的关联可能是其在西方化人群中下降的原因,他们的饮食富含脂肪和纤维。

Chiu等人表明响应HDM的气道微生物菌群失调及其与肠道微生物群的相互作用与儿童早期过敏性呼吸道疾病有关。因此,肠道微生物群的饮食调节被认为与过敏过程有关并影响气道和肠道中微生物群的改变。与健康状况的儿童相比,不仅成人,而且患有慢性鼻炎的儿童在特定微生物群的相对丰度方面也存在显著差异。这些结果支持我们的发现,即IgE介导的AR炎症反应特征可能影响气道微生物群。差异丰富的分类群所显示的变异潜力为未来的研究提供了一个起点,有可能改善患者的预后。然而,关于AR和HC之间的气道微生物群多样性是否存在差异,结果并不一致,这可能是由于研究人群中不同的区域环境、不同类型的过敏原和不同数量的过敏原所致。

代谢组学是组学技术的一个分支,它系统地分析生物体中所有低分子量代谢物的浓度。代谢物为建立强大的探索性工具以监测疾病状态提供了机会,并有助于解释疾病的病理生理机制。血清或尿液样本的代谢组学分析已广泛应用于许多疾病,以识别早期疾病检测和治疗结果预测的标志物。以前,尿液的代谢组学特征已被证明可以区分健康儿童和哮喘患者,区分急诊室不稳定哮喘患者和临床稳定哮喘患者,以及区分成人哮喘和慢性阻塞性肺病患者。

在本研究中,我们报告了AR患者和健康受试者之间的差异代谢特征。用UPLC-MS/MS技术鉴定血清中的所有差异代谢物。进行多变量分析以阐明两组之间的差异。我们开发了稳健可靠的OPLS-DA模型,表征了26种不同的代谢物和16种受干扰的代谢途径。亚油酸代谢、花生四烯酸代谢和咖啡因代谢,前3个显著改变的代谢途径已被确定。值得注意的是,花生四烯酸(AA)代谢网络产生重要的炎症介质,这些介质被认为是多种炎症相关疾病的标志,包括过敏性哮喘。我们发现AR患者血清中与花生四烯酸代谢相关的代谢物发生显著变化,提示AR的形成和发展可能与AA代谢异常有关。在AA/环氧合酶(COX)途径中,造血PGD合酶(hPGDS)催化PGH2异构化为PGD2,这使其成为治疗过敏性炎症的有趣靶标。在本研究中,AR患者的前列腺素(PG)D2水平显著高于健康志愿者,这表明PGD2信号传导可能是一种很有前途的生物标志物,因为IgE与肥大细胞的结合会触发PGD2的释放,从而激活嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。周等人。使用基于NMR的代谢患者研究了花粉病患者的血清样本,发现花粉病可以改变患者能量、氨基酸和脂质的代谢特征,这可能是花粉症患者的诊断和/或预后标志物。Adamko等人提供了概念性证据,表明排泄的尿液代谢物的代谢组学分析可以区分AR患者的严重程度。最近的一项血清代谢组学研究表明,至少有9种代谢物(13(S)-HPODE、胆红素、白三烯D4、次黄嘌呤、L-甾体胆红素、N-琥珀酰-L-二氨基庚二酸、叶绿素、15-羟基二十碳四烯酸和尿酸))在AR患者的血清中显著改变。另一项研究确定了能够可靠和正确预测AR患者舌下免疫疗法疗效的血清生物标志物。这些研究可能有助于更好地了解潜在的发病机制,并为深入研究AR提供代谢证据。

对患病个体的微生物组和非靶代谢组的综合分析初步揭示了差异微生物和差异代谢物之间的关系,并指出了亚油酸和花生四烯酸代谢这两个主要的脂质代谢途径。我们的多组学研究证明了不同细菌属和代谢物之间的相关性。虽然这些差异表达代谢物的原因可能是也可能不是微生物群结构的改变,但营养稳态也可能在宿主-微生物组界面上发挥作用。

我们假设过敏性鼻炎急性加重期间代谢物和免疫环境的改变促进了克雷伯氏菌和葡萄球菌等有害细菌在呼吸道的定植增加,并且宿主-微生物群的相互作用影响宿主免疫系统,影响亚油酸等代谢途径代谢和花生四烯酸代谢,促进过敏反应。越来越多的证据表明,来自致病性和机会性细菌的细菌代谢物、毒素和结构成分可能会刺激有害的免疫反应,从而导致呼吸道疾病的发病机制。我们的研究为深入研究AR的机制提供了有力的证据,但仍然存在很大的局限性。本研究的样本量很小,未来需要增加样本量的研究来进一步阐明已识别的因素以及脂质和代谢途径在过敏性鼻炎恶化中的作用。过敏性鼻炎可分为多种亚型,例如季节性/常年性、间歇性/持续性、单敏/多敏和轻度/中度/重度。未来,针对不同亚型变应性鼻炎患者寻找特异性、灵敏、可靠的生物标志物,将为更精准的疾病分类和个体化靶向治疗开辟新途径。

结论

总之,与HC志愿者相比,AR患者的上气道中存在相对丰度和结构组成不同的微生物。了解气道微生物群的作用可能有助于调节AR的治疗策略。目前的代谢组学研究表明,AR患者和HC之间存在26种可识别的差异代谢物和16种扰乱的代谢途径,其中涉及免疫调节。鉴定出的代谢物有助于了解过敏性鼻炎的病理生理学,需要进一步的靶向代谢组学来改进治疗策略。

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关键词:
微生物,代谢,差异,分析,样本

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