大有可为！更富成药潜力的工程化IL2

前言

IL-2作为T细胞生长因子，通过对效应T细胞和记忆T细胞作用来促进免疫作用，还可以通过Treg来调节免疫耐受。IL-2最早发现在活化的T细胞培养液上清中，在后期的开发中作为第一个被批准的免疫疗法用于增强患者T细胞免疫和NK细胞群。尽管其疗效显著，但高剂量的IL-2治疗仍然存在需要克服的障碍，其半衰期短(<15min)，给药剂量大，并且存在严重的非特异毒性。因此，改善以IL-2为基础的生物制剂的设计和作用模式成为研究热点。

IL-2通过与IL-2R结合调节免疫反应，高亲和力IL-2R（Kd~10pM）受体由3部分组成：CD25，CD122（同时也是IL-15R），CD132（同时也是IL-4R，IL-7R，IL-9R，IL-15R和IL-21R）。如图1，三聚物主要表达在CD8+效应T，CD4+效应T，CD4+Treg，ILC2s和CD56brightNK。中亲和力IL-2R（Kd~1nM）由CD122和CD132组成，主要表达在CD8+记忆T，CD4+记忆T和CD56LowNK中。IL-2与IL-2R结合后激活效应T细胞和NK细胞的JAK1-JAK3-STAT5、PI3K-mTOR1和MAPK通路以支持T、Treg、NK和ILC2s细胞的功能。

了解IL-2与IL-2R不同亚基间的动力学特征有助于开发选择性的IL-2类似物。IL-2以低亲和力(Kd ~ 10 nM)与CD25短暂结合，具有非常快的开启和关闭速率(30s)。而CD122(Kd ~ 450 nM)和CD132 (Kd ~ 750 μM)更低。然而，在细胞膜中，IL-2R亚基的表达量高，CD25结合IL-2后形成复合物，复合物以顺式方式呈现在CD122和CD132上，最终形成IL-2-CD25-CD122-CD132的四元复合物，此为高亲和力的IL-2R。如果CD25缺失，则亲和力减弱。通过IL-2-CD25或仅IL-2稳定CD122-CD132复合物对启动IL-2R信号通路至关重要。IL-2-IL-2R四元复合物的晶体结构验证了这一点。

生物工程制备的IL-2蛋白以靶向细胞

得益于CD25的独特贡献，具有三聚体高亲和力IL-2R使得生物工程制备的IL-2蛋白具有显著治疗效果。这些工程IL-2类似物可以有选择性的靶向Treg细胞，因为T细胞比其他细胞(包括效应T细胞)表达更高水平的CD25。在人外周血单个核细胞中，CD25和三聚体IL-2R不仅存在于Treg细胞中，也存在于许多细胞CD45RO+CD4+抗原表达细胞和大多数CD56brightCD16lowNK细胞中。三聚体IL-2R也在少数CD4+和CD8+幼稚T细胞和CD45RO+CD8+抗原表达的T细胞上检测到。具有靶向和/或增强CD122结合的工程IL-2类似物对二聚体IL-2R表现出更高的选择性。在癌症免疫治疗的背景下，这些类型的工程IL-2类似物有可能优先靶向CD8+记忆T和NK细胞。

生物工程化的IL-2

早期对于IL-2蛋白的设计集中于通过与其他蛋白(如免疫球蛋白或者白蛋白)融化表达，或者与特定抗体融合，使得IL-2靶向到特定的肿瘤部位，从而延长其半衰期。开发具有选择性高亲和力IL-2R的IL-2的突变体通常需要减少IL-2与CD122或者CD25的相互作用。包括四类：IL-2 muteins，PEGylated IL-2，IL-2-anti-IL-2 免疫复合体和IL-2-CD25融合蛋白。

▌ IL-2 muteins

a）对二聚体IL-2R具有选择性的IL-2突变体：IL-2突变蛋白发展之初是为了减少高剂量IL-2对于癌症患者的毒性。IL-2突变包含氨基酸突变，以改变IL-2与其三个受体链之间的相互作用。最初，对IL-2进行广泛突变，以确定IL-2-IL-2R氨基酸的相互作用，也是与IL-2R亚基结合的关键所在。随后，IL-2与IL-2R三聚体结合的晶体结构证实了诱变策略，并为开发对IL-2R三聚体和二聚体优先选择性的IL-2R激动剂提供了结构基础。突变后的IL-2和IL-2超因子能够更强的刺激CD8+T细胞的能力，并使得NK细胞具有更强的杀伤黑色素瘤的作用。该突变 IL-2在降低肺转移方面也是IL-2超因子的两倍，并且作用于CD8+T更强。

b）对三聚体IL-2R具有选择性的IL-2突变体：IL-2突变优先刺激三聚高亲和的IL-2R，并且与CD122作用减弱。融合突变体IgG(IL-2N88D)2破坏IL-2与CD122之间的范德华力，以减弱IL-2信号，不刺激IL-2R二聚体表达的CD8+T细胞和NK细胞，对Treg细胞的IL-2R三聚体具有选择性，与IL-2相比，其效力低6-9倍。另外也有IL-2的Fc融合蛋白，削弱与CD122残基的相互作用。使得其只对Treg细胞有反应。因此，这两种突变体增加了它们对IL-2R三聚体的相对选择性，但是由于与CD122结合效率低而降低了诱导IL-2R信号转导的整体能力，即使在IL-2R三聚体的情况下也是如此。因此，在靶向Treg细胞时，必须调整这些突变蛋白的剂量，以补偿它们的总体活性低于IL-2。与IgG或IgG Fc片段的融合通过这类突变蛋白延长了IL-2R信号的持久性。

c）IL-2突变蛋白作为IL-2R拮抗剂：IL-2突变体也被开发为具有拮抗作用，它仅与一个或两个IL-2R亚基强结合，而不与CD122或CD132结合，从而阻止IL-2R功能信号复合体的形成。此外，这种类型的突变蛋白与IL-2R干扰野生型IL-2的结合，因此它们起拮抗作用。

d）正交IL-2-IL-R突变对，IL-2和CD122都发生了突变，形成了一个IL-2及其受体相互唯一应答的系统，而不是野生型IL-2。首先，对CD122进行突变(H134D和Y135F)，在三聚体和二聚体IL-2Rs中取消IL-2的结合和信号转导，生成正交的CD122。这种正交的IL-2R复合物的潜在价值主要在于基于细胞的治疗。比如正交的引入将CD122转移到表达嵌合抗原受体的细胞毒性T淋巴细胞或Treg细胞中，可使其在体内通过正交IL-2选择性扩增，不仅避免了非特异性毒性，也避免了宿主来源Treg细胞、效应T细胞、NK细胞的脱靶反应。

e）IL-2 minic。最近，一个计算设计IL-2模拟物(命名为Neo-2/15)省略了含有CD25接触位点的α-螺旋，与CD122产生高亲和力的结合，而非CD25。该模拟物的结构特征可产生一种比IL-2更稳定的IL-2R激动剂。相对应的，Neo-2/15可以在含有CD122和CD132的细胞上复制IL-2或IL-15信号，并且对中间亲和力的IL-2R表现出比IL-2超因子更高的选择性。与突变蛋白不同，Neo-2/15不包含氨基酸替换，不具有免疫原性，缺乏与IL-2相关的非特异性毒性。因此，设计具有选择性表达高亲和力三聚体IL-2R的细胞因子，如Treg和效应T细胞，是另一种有吸引力的方法。

▌ PEGylated IL-2

通过聚乙二醇化以延长IL-2的半衰期。对IL-2R二聚体具有选择性的聚乙二醇化IL-2：NKTR-214，也被称为bempegaldesilin，在IL-2的CD25界面或附近的赖氨酸残基上平均含有6个PEG基团，包括疏水中心和极性外围，可以有效地阻断高亲和力IL-2R的激活聚乙二醇化IL-2R。对IL-2R三聚体具有选择性：NKTR-358是一种稳定的PEG化IL-2R激动剂，它是由人IL-2与10倍的PEG过量反应而开发的，并通过体内筛选23种候选结合物具有有效的Treg细胞刺激活性。

▌ IL-2免疫复合物

细胞因子-抗细胞因子单克隆抗体复合物是增加细胞因子生物半衰期和对IL-2R三聚体或二聚体选择性的另一种有效方法。

▌ IL-2–CD25融合蛋白

另一种发展Il-2R选择性二聚体的潜在方法IL-2将其预结合到CD25的可溶性形式上。这种方法对IL-15 - IL-15Rα融合蛋白很有效，因为IL-15以高亲和力结合IL-15Rα(Kd = 1011 M)，形成一种稳定的复合物，通过二聚体IL-2R1很容易激活CD8+T记忆T细胞和NK细胞。

临床上哪一种的IL-2是最好用的？

上述讨论的IL-2类似物表现出预期的高亲和力或中亲和力的选择性和IL-2R与临床前研究的有效性。其中一些药物正在进行临床测试(表1)。然而，一个重要的未回答问题是，哪种药物在临床中表现最好。理想的工程IL-2应该对靶细胞显示高选择性和有效性，增加的稳定性和半衰期，低毒性和可忽略的免疫原性。在未来几年，对于了解患者从中获益情况值得深入关注。

参考文献： 

Rosmely Hernandez et al. Engineering IL-2 for immunotherapy of autoimmunity and cancer. Nat Rev Immunol. 2022 Feb 25