代谢组学诊断骨关节结核患者中潜在的新型血清生物学标志物

Novel Potential Diagnostic Serum Biomarkers of Metabolomics in Osteoarticular Tuberculosis Patients: A Preliminary Study.

Chen X, Ye J, Lei H, Wang C.

Front Cell Infect Microbiol, 2022, 12: 827528.

doi: 10.3389/fcimb.2022.827528. eCollection 2022.

PMID: 35402287

近日，Frontiers in Cellular and Infection Microbiology杂志在线发表了一项关于解放军总医院第一医学中心和第八医学中心检验科合作开展的基于液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS）诊断骨关节结核患者血清代谢组学相关标志物的初步研究（Novel Potential Diagnostic Serum Biomarkers of Metabolomics in Osteoarticular Tuberculosis Patients: A Preliminary Study）。该研究利用质谱技术对临床上目前较易漏诊的骨关节结核患者的血清进行代谢组学分析，探究疾病状态和健康状态时血清中代谢物的变化，从机体代谢的角度为骨关节结核的实验室诊断提供了新的思路和方法参考。解放军总医院第一医学中心检验科陈汐濛为文章的第一作者，解放军总医院第一医学中心检验科王成彬教授和解放军总医院第八医学中心检验科雷红教授为文章的通信作者。

研究背景

骨关节结核是由结核分枝杆菌直接感染骨及关节组织或由其他感染部位迁移引起的肺外结核，发病率约占肺外结核总体的3%。脊柱是骨关节结核主要的好发部位，尤以胸椎和腰椎最为常见，其病理变化主要是骨质的破坏及相应的功能丧失，以及在病灶周围产生结核病灶特有的“冷脓肿”。由于该病早期的临床表现特异性差，相应患者也无明显的结核分枝杆菌感染表现，如发热、乏力、盗汗等，故常延误诊断，严重影响治疗和预后。另一方面，骨关节结核是少有的“少菌”结核病，在相应病灶部位菌量低，临床实验室开展的传统结核病检查项目如分枝杆菌培养、抗酸杆菌染色镜检、组织病理学检查等均易出现假阴性结果，新兴的分子生物学检查如Gene Xpert MTB/RIF及结核分枝杆菌核酸检测等若为阴性结果也不能完全排除该病，故提高骨关节结核的诊断效率已经成为当前临床实验室亟需解决的热点问题之一。

研究队列设计、代谢组学分析

收集2018年11月至2019年11月在解放军总医院第八医学中心就诊的最终诊断为骨关节结核患者的血清30份（结核病组；TB），同时间段收集在解放军总医院第一医学中心就诊的、较难与骨关节结核进行鉴别诊断的类风湿关节炎和强直性脊柱炎患者血清30份（疾病对照组；DC），另收集来院进行查体的健康成人血清30份（健康对照组；HC）。

结核病组和疾病对照组所纳入的患者均为初诊且此前未接受过任何治疗，排除并发有肿瘤、代谢性疾病、免疫性疾病等可能引起血清代谢物干扰的患者。

代谢组学分析主要包括样本前处理、色谱分离、质谱检测、数据检索四大部分。本研究采用3种模式的色谱分离方法：

（1）反相色谱正离子，主要用于带正电脂质检测；

（2）反相色谱负离子，主要用于带负电脂质检测；

（3）亲水色谱正离子，主要用于小分子极性物质检测。

最终得到的数据经过检索后进行正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）和诊断试验评价等统计学分析，根据各组间比较的结果筛选出特异性较好的差异代谢物。

1.代谢物数据：对代谢组学的数据进行OPLS-DA分析，3组数据分别基于3种色谱分离模式，具体结果见表1、图1。结果显示，两组间数据的比较均可见分群明显，证实各组数据均有明显差异。代谢物基于P＜0.05、差异倍数＞1.0或＜0.67的标准，结核病组与健康成人组（TB-HC）和疾病对照组（TB-DC）比较共得到68种差异代谢物，包括37种上调代谢物和31种下调代谢物。对这些代谢物进行韦恩图比较分析，共得到19种共有上调代谢物和15种共有下调代谢物（图2），上调代谢物主要是卵磷脂（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、神经酰胺（Cer）和鞘磷脂（SM）等，下调代谢物主要是氨基酸、神经酰胺（Cer）、脂肪酸等。上述34种共有代谢物的基本信息见表2。

2.差异代谢物生物信息学分析：将差异代谢物导入KEGG数据库进行信号通路分析，主要的通路有坏死性细胞凋亡、胆碱代谢、鞘脂类信号通路转导、鞘脂类代谢、甘油磷脂类代谢等（图3）。通过生物信息学结果可见主要信号通路聚焦于细胞相关生物学活动和脂质代谢，与以往研究中结核分枝杆菌已知的病理代谢机制一致性较好。

3.差异代谢物诊断效能评价：对上述的34种差异代谢物进行了敏感度、特异度的计算和ROC曲线的绘制，以评估这些差异代谢物的诊断效能，具体结果见表3。针对临床实用性和灵活性方面的考虑，在本研究中着重于上调的差异代谢物，ROC曲线下面积（AUC）＞0.7通常被认为具有较好的诊断效能，研究以该数值和其他数据作为评估标准排除了SM(d18:0/24:1(15Z)) 和 SM(d18:1/14:0)，进一步发现PC(o-16:1(9Z)/18:0)、PC(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/18:0)、PC(18:0/20:3(5Z,8Z,11Z))、PC(18:0/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、SM(d18:1/20:0)、SM(d18:1/24:1(15Z))、SM(d18:0/16:1(9Z))、SM(d18:0/18:1(11Z)) 和 SM(d18:1/18:1(11Z))可能是具有较好诊断效能的差异代谢物。研究进一步对挑选出的9种差异代谢物作散点图分析（图4），发现PC(o-16:1(9Z)/18:0)、PC(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/18:0)、PC(18:0/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、SM(d18:1/20:0)和 SM(d18:1/18:1(11Z))这5种差异代谢物在结核病组-健康对照组及结核病组-疾病对照组各组间差异均有统计学意义，但疾病对照组-健康对照组间差异无统计学意义，符合实验最初的潜在诊断生物标志物的预想。

4.差异代谢物联合诊断模型的构建：为了进一步提高相关代谢物的诊断效能，研究将上述5种差异代谢物带入诊断模型中进行分析。首先，我们先根据类别的不同分别对PC和SM所涉及的代谢物分别构建模型A和模型B，两种模型的AUC值分别为0.8820和0.7940，另外模型A的敏感度和模型B的特异度均表现得较为突出，提示相应代谢物类别可能涉及的预测方面。之后，研究又将两种SM类代谢物分别带入PC模型中，建立模型C和模型D，综合考量发现模型C的诊断效能略高于模型D（表4）。最后，再将5种差异代谢物共同组成1个联合诊断模型E，但经过比较发现仍然是模型C的诊断效能略胜一筹。综上认为，由PC(o-16:1(9Z)/18:0)、PC(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/18:0)、PC(18:0/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、SM(d18:1/20:0)等4种差异代谢物组成的联合诊断模型C可能更为合适。

研究的意义及展望

本研究基于LC-MS/MS技术对骨关节结核及其鉴别诊断疾病组患者和健康成人的血清进行了代谢组学分析，从疾病状态和正常生理状态的代谢组学角度为骨关节结核的实验室诊断提供了新的方法参考。同时，根据实验结果最终筛选出5种可能作为潜在辅助诊断生物标志物的血清差异代谢物，并依此构建了相对诊断效能较好的联合诊断模型，为后续研究及结果的验证工作奠定了基础。

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供稿：陈汐濛

编辑：孟    莉 

审校：范永德

发布日期：2022-05-07

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