线粒体抗病毒信号蛋白通过维持线粒体稳态来抑制肝脏脂肪变性

对发表于HEPATOLOGY的一篇研究进行分享和展望，以启迪临床。

NAFLD是一种代谢性肝病，影响全世界高达25%的成年人口，且发病率逐年升高。NAFLD包含了从单纯的脂肪变性到NASH，具有进展为肝硬化、肝癌和肝衰竭的风险。由于其发病机制的复杂性和异质性，NAFLD的分子机理尚不清楚。

能量代谢紊乱和线粒体功能障碍是NAFLD发展过程中的重要因素。然而，线粒体功能障碍导致肝脏脂肪变性（HS）的分子机制不明确。线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）是位于线粒体外膜的信号调节因子，协助宿主抵御病毒感染，其在天然免疫系统中的功能和作用机制已得到广泛证实。近期有研究表明，MAVS能够介导免疫反应和代谢调节之间的相互作用。此外，有报道MAVS蛋白在NAFLD小鼠肝脏中的表达显著下调。然而，MAVS如何参与线粒体代谢和能量调节，以及MAVS如何影响NAFLD的发生进展仍有待研究。

结果1

NAFLD中MAVS的表达显著下调

图1A、B：与对照组相比，NAFLD患者和小鼠模型的肝组织中MAVS蛋白表达显著下调。

图1C、D：MAVS的免疫组化染色显示，与对照组相比，NAFLD患者和小鼠模型的肝脏切片中MAVS蛋白表达下调。

图1E：与未处理的肝细胞相比，经油酸（OA）处理的原代肝细胞中MAVS蛋白水平下调，而TGFβ或LPS处理对枯否细胞和肝星状细胞的MAVS蛋白表达水平无影响，这些结果在人类Huh-7肝细胞系和LX2星状细胞系中也得到了证实，表明NAFLD与肝细胞中的MAVS蛋白之间存在着特异且较强的关系。

结果2

MAVS抑制肝细胞内脂质积聚

图2A、B：ORO染色提示，经OA刺激后，与WT组相比，Mavs-KO肝细胞的脂质积聚增加，细胞内的甘油三酯和总胆固醇水平也显著升高。

图2C、D：基因集富集分析和热图分析表明经OA刺激后，与WT组相比， Mavs-KO肝细胞中与脂肪生成相关的通路明显上调。

图2E-G：MAVS在小鼠原代肝细胞中的过表达减少了OA诱导的脂肪堆积和促脂肪生成基因的表达。

结果3

敲除MAVS基因加剧了饮食诱导的HS

图3A-D：通过H&E染色、油红染色和肝组织中甘油三酯/总胆固醇/未酯化脂肪酸含量的检测定量评估肝脏脂肪变性，发现MAVS敲除显著加重了饮食诱导的肝脏脂肪堆积。

图3E-I：HFD饮食的Mavs-KO小鼠肝脏组织中脂肪生成基因的相对转录水平上调，ALT和AST水平升高，出现严重的胰岛素抵抗，这些发现提示MAVS对NAFLD，尤其是对HS的保护作用。

结果4

肝脏特异性的MAVS基因敲除可加重HS

图4A-C：鉴于MAVS对NAFLD中脂肪组织以外的肝脏具有特异性的调节作用，研究者构建Mavs-HKO小鼠进一步研究了肝细胞来源的MAVS蛋白在NAFLD早期进展阶段所发挥的作用。结果显示，在HFD喂养12周后，Mavs-HKO组小鼠的肝脏重量和肝脏重量/体重比有所增加，而白色脂肪重量没有显著变化。

图4D-I：肝脏特异性MAVS敲除加重了HS和肝损伤，表现为肝脏脂肪含量增加，组织脂质积聚增加，血清ALT和AST含量升高，血清甘油三酯和总胆固醇水平升高，促脂肪生成途径和基因也广泛上调。

与全身Mavs-KO小鼠相比，Mavs-HKO小鼠表现出较轻的HS，这可能是由于Mavs-HKO小鼠的造模持续时间（12周）短于Mavs-KO小鼠（20周）。这组数据证实了肝细胞来源的MAVS蛋白在预防肝脏脂肪病理改变中的特殊和重要作用。

结果5

Mavs-KO加重HS大鼠线粒体功能障碍

图5A：分别用OA刺激WT和Mavs-KO小鼠肝细胞，并检测其耗氧率（OCR），结果表明MAVS敲除后肝细胞的基础呼吸、ATP耦联呼吸和最大呼吸均显著降低。

图5B：从OA刺激的WT和Mavs-KO小鼠原代肝细胞中分离出线粒体以测量OCR，直接证明了MAVS敲除导致线粒体呼吸功能缺陷。

图5C：用肉碱棕榈酰反式酶1抑制剂-依托莫西（etomoxir）检测到敲除MAVS也降低了脂肪酸氧化。

图5D：TMRM染色表明敲除MAVS降低了OA刺激后的线粒体膜电位。

图5E：靶向代谢组学分析显示，MAVS敲除导致三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化（OXPHOS）代谢产物显著下调，糖酵解代谢产物上调。

结果6

VDAC2与MAVS功能性结合

图6A：在感染MAVS的细胞中发现了四种线粒体蛋白，分别是VDAC2、PACS2、ATPIF1和MRPL17，但在阴性对照中没有发现。

图6B：在这些候选基因中，免疫共沉淀分析表明VDAC2、PACS2和ATPIF1与MAVS存在蛋白质互作。

图6C：在OA刺激下，MAVS与VDAC2之间的作用被特异性下调，而MAVS与PACS2或ATPIF1之间的相互作用没有变化，表明MAVS与VDAC2之间存在相互作用。

图6D-F：免疫荧光染色、免疫沉淀分析和GST pull-down实验进一步证实了MAVS与VDAC2的直接相互作用。

图6G、H：计算机模拟预测MAVS与VDAC2蛋白的N端延伸相互作用，这一点得到了免疫共沉淀分析的证实。

结果7

MAVS对线粒体功能和HS的作用

由VDAC2介导

图7A：通过siRNA转染来敲除MAVS过表达的原代肝细胞中的VDAC2。

图7B-D：肝细胞中VDAC2基因的敲除抵消了MAVS对过度脂肪沉积的保护作用和对脂肪生成基因的保护性下调。

图7E、F：TMRM染色显示VDAC2的敲除抵消了MAVS过表达引起的线粒体膜电位升高。

图7G：OCR显示，MAVS对线粒体呼吸能力的保护作用也被VDAC2敲除所抵消。

图7H：靶向代谢组学分析显示VDAC2基因敲除导致三羧酸循环和氧化磷酸化代谢产物下调，糖酵解代谢产物代偿性上调。

这些结果表明，VDAC2介导了MAVS对线粒体功能和HS的保护性作用。

主编点评

NAFLD据测影响全球成年人口的25%，由于其致病的潜在分子机理尚不明确，导致临床上匮缺有效的药物治疗措施。线粒体功能障碍被认为是NAFLD发生进展的重要因素，而定位于外膜的线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）是宿主抵御病毒感染的重要信号调节因子，在线粒体代谢和能量调控方面发挥着重要作用。近期有研究报道，MAVS是介导免疫反应和代谢稳态之间相互作用的关键蛋白。然而，MAVS在NAFLD发病机制中的作用仍不清楚。

本期分享的文章有以下亮点：

1. 本研究通过CRISPR技术构建了全身敲除和肝脏特异性敲除MAVS基因的小鼠动物模型，发现MAVS对高脂饮食诱导的NAFLD具有保护作用。在NAFLD的发病过程中，MAVS敲除导致线粒体功能障碍，表现为线粒体呼吸功能缺陷和膜电位受损。靶向代谢组学结果也进一步支持与三羧酸循环和氧化磷酸化途径相关的代谢产物表达明显下调，糖酵解代谢产物代偿性上调。

2. 利用转录组学技术，阐明肝脏特异性敲除MAVS基因后出现广泛的代谢紊乱，基因集富集分析（GSEA）提示与脂质代谢/脂肪生成相关的胞内信号途径基因表达显著上调。

3. 进一步的机制研究，通过质谱分析、GST pull-down实验、计算机模拟和免疫共沉淀证实了MAVS和VDAC2的蛋白质相互作用，介导了其对线粒体功能和肝脏脂肪变性的保护性作用。

展望：

目前多项针对免疫/炎症信号通路的临床前研究在治疗NAFLD方面显示出了可喜的成果（例如TLR4拮抗剂JKB-122、CCR5的人源性单抗leronlimab以及姜黄素等），鉴于MAVS蛋白对天然免疫和炎症反应的重要调控作用，这也是今后能够拓展的研究方向。此外，MAVS的翻译后修饰（磷酸化、泛素化和琥珀酰化）也对蛋白的转运、功能和稳定性发挥了重要作用，值得进一步深入阐明。

文献索引：Fu J, Hu F, Ma T, Zhao W-J, Tian H, Zhang Y, et al. A conventional immune regulator mitochondrial antiviral signaling protein blocks hepatic steatosis by maintaining mitochondrial homeostasis. Hepatology. 2022;75:403–418. doi:10.1002/hep.32126