Science：要把正常细胞变成癌细胞，总共分几步？

在过去二十年中，科学家们在癌症中发现了数千种基因突变，但了解这些基因突变如何影响体内肿瘤的生长和扩散仍然具有挑战性，因为每个患者的肿瘤都可能具有许多不同的基因突变。这导致了从癌症患者中推断基因型和表型的联系，如果能够将癌症中的基因突变或突变组合与其表型系统地联系起来，将大大促进我们对癌症发病机制的理解，并帮助开发相应的治疗方法和药物。 2022年4月29日， Aviv Regev  等人在 Science 期刊发表了题为： Stepwise-edited, human melanoma models reveal mutations’ effect on tumor and microenvironment 的研究论文。 研究团队使用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术， 在人健康皮肤黑色素细胞中依次编辑5种黑色素瘤相关基因突变或其组合，这些编辑后的细胞生长并增殖为具有黑色素瘤特征的肿瘤，包括快速生长、侵袭能力增强，以及特定基因激活和色素沉着模式 。 由于该研究可以一次引入一个基因突变，因此可以确定特定基因突变及突变组合的具体影响。这项研究 不仅揭示了黑色素瘤中的关键基因突变，还提出了一种研究特定基因在癌症中作用的新方法。 该研究的第一作者 Eran Hodis 在 Aviv Regev 实验室读博期间就开始了这项研究工作，如今他是哈佛大学布莱根妇女医院住院医师，而 Aviv Regev 于2020年加入Genentech 公司任研究与早期开发的执行副总裁。 Eran Hodis 表示，这项研究是首次使用精确控制的基因工程技术从完全分化的细胞而非干细胞开始构建人类癌症模型。这一方法将为在许多其他癌症建立类似模型开辟机会，有助于加速癌症遗传学与特定疾病特征的关联研究。 该研究的通讯作者 Aviv Regev 博士表示，为了设计这些癌症模型，必须将精确的基因编辑技术与高分辨率、大规模并行的单细胞基因组学分析相结合，来生成和表征细胞和肿瘤，并通过机器学习来分析数据。总之，这些研究发现让我们对哪些基因突变及其组合导致细胞的癌变有了前所未有的认识。 

Aviv Regev 在研究黑色素瘤时，将其基因型与特定特征或表型联系起来特别困难。这是因为黑色素瘤作为皮肤癌，皮肤暴露在许多外部因素下，例如紫外线。因此黑色素瘤患者中存在着许多外部因素导致的基因突变，而这些基因突变大多并不是黑色素瘤的驱动因素。 而基因突变引入健康的人类黑色素细胞，就可以在不受干扰的观察基因突变对黑色素瘤的影响。 研究团队首先用 CRISPR-Cas9 基因编辑在健康的人类黑色素细胞依次引入了黑色素瘤中常见的  CDKN2A 、BRAF 和 TERT 基因突变。这三种基因突变一起出现，会导致细胞表现得像癌细胞一样无限分裂。 接下来，研究团队将已知的黑色瘤相关的抑癌基因 PTEN、TP53 和 APC 分别在上述细胞中做敲除，共产生了9种不同的细胞模型。 分别是野生型人黑色素细胞（WT）、CDKN2A -/- 细胞 （C） 、CDKN2A -/-  + BRAF V600E  细胞 （CB） 、 CDKN2A-/- + BRAFV600E + TERT-124C>T 细胞 （CBT）、 CDKN2A-/- + BRAF V600E  + TERT -124C>T  + TP53 -/- 的细胞 （CBT3） 、CDKN2A -/-  + BRAF V600E  + TERT-124C>T + PTEN-/-的细胞 （CBTP） 、CDKN2A-/- + BRAFV600E + TERT-124C>T + APC-/-的细胞 （CBTA） 、CDKN2A-/- + BRAFV600E + TERT-124C>T + PTEN-/- + TP53-/-细胞 （CBTP3） 、CDKN2A-/- + BRAFV600E + TERT-124C>T + PTEN-/- + APC-/-细胞 （CBTPA） 。 然后，研究团队将上述9种细胞模型植入小鼠体内并进行观察。单细胞 RNA 测序显示，随着更多基因突变的引入，这些细胞逐渐改变其基因表达程序，并且小鼠肿瘤模型与具有相同基因型的人类黑色素瘤患者具有相似的基因表达模式和色素沉着模式。这表明从头构建的黑色素瘤细胞忠实地反映了人类黑色素瘤患者体内出现的肿瘤情况。 黑色素瘤的一个显著特点是在癌症早期就开始转移，这项研究清楚地显示，CBTA 细胞和 CBTPA 细胞转移性最强，也就是敲除了 APC 基因的细胞最具转移型，这提示了我们 APC 基因的失活可能有助于黑色素瘤的转移 。 该研究还显示，CDKN2A -/-  + BRAF V600E  + TERT -124C>T  基因突变一起出现时会导致细胞表现得像癌细胞一样无限分裂。上述三个突变加上 PTEN 和 TP53 基因失活时，肿瘤生长速度最快。 总的来说，该研究通过 CRISPR-Cas9 基因编辑技术对人类健康黑色素细胞进行编辑，逐步引入1至5个基因突变，涉及黑色素瘤中6种常见的基因突变，分别是  CDKN2A、BRAF、TERT、PTEN、TP53、APC。共构建了9种基因不同的细胞模型。 然后利用生理评估、组织病理学、单细胞 RNA 测序，机器学习算法，在体外和体内对这些模型进行了表征。 通过这些细胞模型，将黑色素细胞基因型与基因表达程序、复制和永生、恶性肿瘤、快速生长、色素沉着模式、肿瘤转移和组织病理学特征等表型联系起来。并发现了引起黑色素瘤肿瘤生长、转移和肿瘤微环境改变的基因突变。 更重要的是，该研究不仅揭示了黑色素瘤中的关键基因突变，还提出了一种研究特定基因在癌症中作用的新方法。