CAR-T混搭小分子前药体系，治疗实体瘤

前言

肿瘤免疫治疗主要分为两类：一种是通过免疫检查点阻断疗法抑制肿瘤的免疫逃逸，从而使得免疫细胞重新识别并杀伤肿瘤细胞；另外一种是将肿瘤细胞的特征告诉免疫细胞，让其去定位并杀伤肿瘤细胞，也称为使用效应T细胞的过继细胞疗法(Adoptive cellular therapy, ACT)，如TCR-T、CAR-T、TIL等。 作者 | 氯化铁   

图1：T细胞疗法流程图

CAR-T(Chimeric Antibody Receptor Engineered T Cell)和基因修改的T细胞受体(Gene Modified TCR-T)两种技术的共同点在于都是通过基因改造的手段提高患者自身T细胞受体对特异性癌症细胞抗原的识别和杀伤能力(图1)；不同之处在于两者识别抗原的机制不同，其中TCR-T主要是通过识别并结合MHC呈递的抗原从而激活T细胞，而CAR-T是与肿瘤表面的特异性抗原结合后激活T细胞。

因此TCR-T疗法中组织相容性抗原配型等问题限制了其发展，而CAR-T疗法经历了四代的发展，主要是引入共刺激结构域(CD28;4-1BB等)或加入细胞因子和共刺激配体以增强T细胞的应答，从而增强对肿瘤的杀伤能力(图2)[1]。   

图2：两种使用效应T细胞的过继细胞疗法（TCR-T和CAR-T） 

而由于只有血液瘤中含有较为特异性的靶标，因此目前CAR-T技术主要应用于血液瘤的研究，在实体瘤中没有明显的效果，其有效性受到抗原阴性肿瘤细胞的耐药性、肿瘤微环境中的免疫抑制、T 细胞免疫功能的最终耗尽的阻碍。另外在治疗的过程中会有一些毒副作用，例如由细胞因子风暴引起的细胞因子释放综合征、由于改变血脑屏障引起的神经毒性、器官功能衰竭以及对正常B细胞的过度杀伤(图3)等[2]。

图3：CAR-T引起的常见副作用

为了克服这些问题，Scheinberg DA.团队开发了一类新型 CAR-T 细胞，该细胞经过工程改造可表达一种酶，该酶可在肿瘤部位原位激活全身给药的无活性的小分子前药(图4)。并且这些合成酶武装杀伤细胞(Synthetic Enzyme-Armed Killer, SEAKER)在体外和体内的小鼠肿瘤模型中都表现出显著的抗肿瘤活性。这个模块化平台能够联合靶向细胞和小分子疗法来治疗癌症和潜在的其他疾病[3]。

该系统有两个巨大优势，其一是：即使Car-T细胞耗竭以后，仍然能够表达前药酶，对肿瘤持续杀伤。另外一个是：前药释放的小分子毒素，能对异质性肿瘤起到杀伤效果，使得肿瘤不能复发。(解释：很多肿瘤是异质性的，一堆相同的癌细胞里面，有些没有Car-T能识别的受体，单纯Car-T对其可能没有效果，但是这个系统产生的毒素分子却能够无差别杀伤，这样肿瘤就无法东山再起）。

图4：SEAKER细胞疗法的功能模式图

首先为了验证SEAKER方法的可行性，作者选取了在抗体导向的酶-前药治疗(ADEPT)体系中使用较为成熟的两种酶：可水解谷氨酸基团的羧肽酶G2(CPG2) 和水解β-内酰胺的阴沟肠杆菌β-内酰胺酶 (β-Lac)(图5a)。值得注意的是，其中CPG2在ADEPT技术中的使用已经处于临床研究阶段[4]。 

作者设计了四种前药用于初步评估，5'- O – Sulfamoyladenosine (AMS) 是一种高度细胞毒性的天然产物，在 NCI-60 人类肿瘤细胞系中的半数最大抑制浓度 (IC50 ) 为 1.77 nM，由AMS衍生而来的前药AMS-Glu和Ceph-AMS；氮芥类药物ZD2767的谷氨酸前药ZD2767P以及靶向eGFP激酶抑制剂吉非替尼的类似物的谷氨酸前药APdMG-Glu(图5b)。设计合成好所需前药之后，作者测试了这些前药在癌细胞系和原代细胞中的IC50值，四个化合物都适合后续的研究，且AMS-Glu具有最高的选择性。接着作者利用纯化的CPG2和β-Lac在细胞水平检测了这些前药的效果，发现只有在对应前药激活酶的条件下，前药才具有细胞毒性(图5c)，基于这些药物的毒性和选择性的数据，作者选取AMS-Glu和Ceph-AMS进行后续的研究。

图5 前药的设计及细胞水平的体系验证图

接着作者想要验证前药AMS-Glu和Ceph-AMS能否在表达CPG2或β-Lac的细胞内激活。这需要细胞能够表达有活性的前药激活酶，并且这些酶对细胞没有毒性，为此作者先设计了CPG2-sec(分泌型)和CPG2-tm(锚定于膜内型)(图6a)，其中分泌型可能会产生较高的局部酶浓度，但如果产生体内扩散可能会导致毒性，而膜锚定形式可以更紧密的定位于肿瘤细胞附近，但其表达和活性可能因靠近脂质双分子层受到阻碍。

通过利用CPG2基因盒进行逆转录病毒转导，作者在HEK293T细胞内进行了初步的实验，表达CPG2-sec的细胞上清液，而不是表达CPG2-tm和eGFP的细胞上清，可以激活AMS-Glu的浓度依赖的细胞毒性(图6b-c)。AMS-Glu在直接处理过表达CPG2-sec或CPG2-tm的细胞中也显示剂量依赖的细胞毒性(图6d)，同时在过表达β-Lac的细胞中Ceph-AMS也可以被激活。

总之，这些实验结果表明前药可以在过表达前药激活酶的细胞中被激活。

图6：前药在相应过表达前药激活酶细胞中可以被激活

接下来，作者将前药激活酶(分泌型CPG2或β-Lac)整合到CAR-T体系中生成SEAKER细胞(图7a)，将CPG2-19BBz和β-Lac-19BBz构建体在细胞中进行表征，首先检测了anti-CD19 SEAKER细胞与Raji (CD19+)或 SET2 (CD19−) 共培养后，细胞内CPG2和β-Lac酶的表达量(图7d)，结果显示SEAKER细胞能使得Raji(CD19+)细胞内的CPG2和β-Lac酶的量显著升高，此外，来自SEAKER细胞的上清液激活了相应前药对SET2细胞的细胞毒性(图7e)。在Raji异种移植模型中，两种 SEAKER 细胞类别也表现出与19BBz CAR-T细胞相当的抗肿瘤功效(图7c)。这些数据表明两类SEAKER细胞都保持了其内在的CAR-T细胞功能，同时还获得了激活相应小分子前药的能力。 

图7：表达CPG2和β-Lac的SEAKER细胞的构建和表征

为了评估SEAKER系统在小鼠模型中的抗肿瘤功效，作者评估了AMS-Glu和Ceph-AMS的体外药理学和体内药代动力学特性，结果显示两种前药在小鼠和人的血浆和肝微粒体中都是稳定的，并表现出可接受的血浆蛋白结合率，同时作者还研究了小鼠体内CAR-T细胞的药代动力学，以确定前药给药的最佳时间。然后作者在体内验证了SEAKER细胞能够在体内激活前药的抗肿瘤活性。最后，为了验证SEAKER细胞能否在体内对抗原阴性的细胞异质肿瘤有效，作者采取了含有Nalm6-mCherry/gLuc (CD19+)和Nalm6-eGFP/fLuc (CD19−)的混合肿瘤模型，在小鼠种瘤十天后接种β-Lac-19BBz SEAKER细胞，四天后使用前药Ceph-AMS处理，一段时间后利用活体成像检测肿瘤的大小，在用SEAKER细胞和前药处理的小鼠中观察到肿瘤细胞明显变小(图8g-h)。

CAR-T细胞失效的原因之一是由于慢性抗原刺激，它们的免疫细胞毒性功能会随着时间的推移而耗尽。于是他们检测了耗尽的SEAKER细胞是否会维持前药激活酶的表达和活性，从小鼠中提取的 SEAKER细胞显示出衰竭标志物 TIM3、LAG3 和PD1，但>90%的这些细胞继续表现出β-Lac酶活性。这些实验表明即使在前药治疗两个疗程后SEAKER细胞仍能存活并具有持续的前药活化能力。

此外，SEAKER-前药在皮下肿瘤模型中也具有显著的功效。

图8：SEAKER 系统在小鼠模型中的抗肿瘤功效

本文建立的SEAKER细胞平台通过靶向、局部激活小分子前药。SEAKER-前药组合在体外和体内提供了增强的抗癌活性，且SEAKER细胞即使在免疫衰竭后仍保持前药激活酶活性。分泌的酶和活化的药物可以扩散到整个肿瘤中，对实体瘤有潜在的好处。

此外，与抗体-药物偶联物和ADEPT等其他药物递送系统相比，SEAKER通过细胞增殖、酶的产生和催化前药活化等次将局部药物放大。总之，作者建立了一个新的细胞治疗平台，将CAR-T细胞免疫治疗与小分子前药的局部激活相结合，提供了一种广泛适用的手段来增强可能扩展到其他疾病的细胞疗法。

参考文献：

[1] Hartmann J, Buchholz CJ. Clinical development of CAR T cells-challenges and opportunities in translating innovative treatment concepts. EMBO Mol Med. 2017 Sep;9(9):1183-1197.

[2] June CH, Milone MC. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 2018 Mar 23;359(6382):1361-1365.

[3] Gardner TJ, Scheinberg DA. Engineering CAR-T cells to activate small-molecule drugs in situ. Nat Chem Biol. 2022 Feb;18(2):216-225.

[4] Francis RJ, Begent RH. A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours. Br J Cancer. 2002 Sep 9;87(6):600-7.