结石研究（23）：草酸、一水草酸钙和草酸钙肾结石患者尿液的氧化应激诱导的过早衰老和端粒缩短

草酸、一水草酸钙和草酸钙肾结石患者尿液的氧化应激诱导的过早衰老和端粒缩短

草酸钙 (CaOx) 肾结石 (KS) 患者的氧化应激是应激性过早衰老 (SIPS) 的一个众所周知的原因。草酸盐和草酸钙一水合物 (COM) 在肾小管细胞中诱导氧化应激，但据我们所知，它们对 SIPS 的影响尚未得到检验。在这里，我们检查了来自 CaOx KS 患者的草酸盐、COM 或尿液是否可以在人肾 (HK)-2 细胞（一种近端肾小管细胞系）中诱导 SIPS 和端粒缩短。年龄和性别匹配的无结石个体的尿液用作对照。在亚致死量中，H 2 O 2KS 患者的草酸盐、COM 和尿液在 HK-2 细胞中诱发氧化应激，表现为蛋白质羰基含量增加和总抗氧化能力降低，但没有结石患者的尿液则没有。SA-βgal染色表明，在用H 2 O 2、草酸盐、COM和来自KS患者的尿液处理后，衰老的HK-2细胞的比例增加。用H 2 O 2 、草酸盐、COM 和KS 患者尿液处理的HK-2 细胞中p16 的表达高于用无结石患者和未处理对照的尿液处理的细胞中的p16 表达。p16 在 SA-βgal 阳性细胞中上调。用 H 2 O 2处理的 HK-2 细胞的相对端粒长度较短、草酸盐、COM 和 KS 患者的尿液比用无结石患者和未处理对照者的尿液处理的细胞中的要高。在 H 2 O 2处理的 HK-2 细胞中，shelterin 成分（TRF1、TRF2 和 POT1）的转录表达降低、草酸盐、COM 和 KS 患者的尿液，在这种情况下表达最高。相对于未经处理的对照，来自没有 KS 的那些人的尿液没有显着改变 HK-2 细胞中的 TRF1、TRF2 和 POT1 mRNA 表达。总之，来自 CaOx KS 患者的草酸盐、COM 和尿液可诱导肾小管细胞中的 SIPS 和端粒缩短。由成岩环境诱导的 SIPS 可能是由 p16 的上调和庇护素成分（特别是 POT1）的下调引起的，并且可能至少部分地促进了 CaOx KS 的发展。

关键词：肾结石，草酸盐，草酸钙，细胞衰老，氧化应激，肾结石，尿液

介绍

泌尿道中的结石或结石主要在肾脏中形成，最常见的类型是草酸钙 (CaOx) ( 1 )。肾结石形成的风险在 30 岁时逐渐增加，在 70 岁时逐渐降低 ( 2 , 3 )。形成 CaOx 结石的高峰年龄在 40 至 60 岁之间（4 - 6岁）。肾结石自古就有文献记载（7），但其发病机制仍远未完全阐明。

众所周知，尿离子饱和度和随之而来的晶体形成是 CaOx 成岩的主要驱动力。包括草酸盐和 CaOx 晶体在内的致石物质通过增加活性氧 (ROS) 的产生，激活炎症，在肾小管细胞中引起氧化应激 ( 8 )。产生的 ROS 选择性地激活 p38 丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 途径 ( 9 )，进一步激活炎症转录因子，包括核因子 (NF)-κB 和转录因子 AP-1 ( 10 , 11 )。Randall 斑块周围的促炎巨噬细胞已在肾组织中得到证实 ( 11 , 12）。氧化应激、炎症和纤维化已在肾结石患者的肾脏组织中得到明确证实 ( 13 – 16 )。蛋白质组学分析表明，肾结石患者的尿液和结石基质中含有丰富的炎症和纤维化蛋白 ( 17 )。这一证据强调了氧化应激和炎症与 CaOx 结石的发展密切相关，并且 CaOx 肾结石可以被认为是一种由氧化应激介导的炎症性疾病。因为年龄与 CaOx 结石形成的风险增加和细胞衰老有关 ( 18 )，所以 ROS 可能介导细胞衰老 ( 19 ))，当衰老细胞积累时，就会发生炎症 ( 20 – 22 )。因此，我们提出了一个假设，即细胞衰老与 CaOx 岩石形成有关。据我们所知，以前没有研究调查过细胞衰老是否有助于肾结石病的发展。

衰老是 Hayflick 和 Moorhead 在 1961 年创造的一个术语 ( 23 )，它被定义为对促进生长的刺激物具有抵抗力的细胞周期停滞的不可逆状态。然而，衰老细胞可以保持代谢活跃并随着年龄的增长而积累，从而导致衰老和与年龄相关的疾病 ( 18 )。已经建立了两种主要的细胞衰老形式，复制性衰老和应激诱导的过早衰老（SIPS）。复制性衰老被认为是由耗尽的细胞分裂（达到所谓的“海弗利克极限”）导致的自然细胞衰老。显着缩短的端粒长度（基因组压力）激活了 DNA 损伤反应（DDR）和 p53-p21 CIP1进一步启动复制性衰老的生长抑制途径 ( 24 )。相比之下，SIPS，也称为压力或异常信号诱导衰老 (STASIS) 或加速细胞衰老，是指细胞因长期暴露于亚致死剂量的压力源而过早衰老。SIPS 比体内复制性衰老更可能发生，因为细胞在整个生命过程中始终暴露于压力源（内源性和外源性）（24）。SIPS 的主要公认诱导剂是致癌激活、氧化应激、抗癌药物和辐射。不激活 DDR 或导致基因组损伤的 SIPS 刺激将激活细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p16 INK4a -pRB 途径以启动衰老。25 )。衰老细胞获得了一些将它们与其他细胞区分开来的特征，从形态变化（扩大和变平）到染色质重组 ( 26 )。细胞衰老的典型因素包括衰老相关 β-半乳糖苷酶 (SA-βgal) 活性增加、p16 INK4a上调、端粒磨损和衰老相关异色病灶 ( 26 – 28 )。

细胞衰老的生理益处包括其强大的肿瘤抑制机制，可阻止癌前细胞的增殖 ( 18 , 21 )。衰老的不利影响也已得到承认。衰老细胞获得与衰老相关的分泌表型 (SASP)，将它们转变为主动产生和分泌促炎细胞因子的促炎细胞 ( 21 )。在 CaOx 肾结石中，草酸盐和 CaOx 晶体诱导氧化应激和炎性细胞因子释放 ( 10 )。除了通过激活 p38 MAPK途径ROS，我们推测细胞衰老可能是氧化应激和 CaOx 岩石形成中炎症之间的重要联系。草酸盐和 CaOx 晶体可能在肾小管细胞中诱导 SIPS，这些过早衰老的细胞会产生放大炎症反应的 SASP 因子。

在这里，我们研究了在用草酸盐、一水草酸钙 (COM) 和 CaOx 肾结石 (KS) 患者的尿液处理人肾 (HK)-2 近端肾小管细胞后是否会诱导 SIPS。来自没有结石（NS）的个体的尿液作为对照。我们确定了 SA-βgal 活性、p16 INK4a表达和端粒缩短。此外，我们还确定了在暴露于 CaOx 致石因子的 HK-2 细胞中，包括端粒重复结合因子 1 (TRF1)、端粒重复结合因子 2 (TRF2) 和端粒 1 (POT1) 的保护素成分的转录表达。

方法

细胞系和 24 小时尿液标本

我们使用了从 10 名参与者获得的 24 小时尿液样本，用于我们之前的研究 ( 29 )，5 份来自 CaOx KS 患者的样本和 5 份来自年龄和性别匹配的无结石 (NS) 个体的样本。使用剩余标本的方案得到曼谷朱拉隆功大学医学院机构审查委员会的批准（IRB 编号 642/63，COA 编号 1189/2020）。供体的人口统计数据和尿液样本的特征显示在表格1.

表格1研究中使用的 24 小时尿样供体的特征。

†通过 HPLC 测量。

‡通过 iCOCI（吲哚反应草酸钙结晶指数）法测量 ( 29 )。

HK-2 细胞系 (ATCC, CRL-2190) ( 30 ) 在 37°C 下维持在含有 10% 胎牛血清 (HyClone) 和 1% 青霉素-链霉素 (GIBCO) 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (HyClone Laboratories) 中5% CO 2和 95% 湿度的气氛。在所有实验中使用第65和第 67代之间的细胞。跨通道计算的 HK-2 的平均直径为 18.2 µm ( 31 )。HK-2细胞用H 2 O 2处理、草酸钠 (NaOx) (Sigma-Aldrich)、COM (Merck-Millipore)、KS 患者的尿液 (n = 5) 和无结石患者的尿液 (NS 尿液) (n = 5) 72 小时。至少一式三份处理培养物。根据它们的吲哚反应草酸钙结晶指数 (iCOCI) 水平 ( 29 )，将 24 小时尿液样本（来自 10 个样本）合并，并分为三组，即：iCOCI 水平低或正常的合并尿液与那些KS 患者的合并尿液具有高 iCOCI，以及 KS 患者的合并尿液具有非常高的 iCOCI。

细胞活力

我们使用四唑染料 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT; Sigma-Aldrich) 检测了处理的细胞毒性。HK-2 细胞在 6 孔板中用 25 µM H 2 O 2、900 µM NaOx、25 µg/cm 2 COM 或 10% (v/v) KS 患者尿液处理 72 小时。未处理的细胞和用 NS 尿液处理的细胞用作对照。随后，将细胞与 MTT (0.5% mg/mL) 溶液在黑暗中在 37°C 在 5% CO 2的气氛下孵育和 95% 的湿度 2 小时。黄色 MTT 在活细胞中还原为紫色甲臜晶体。细胞用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤两次，细胞核用荧光染料 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma-Aldrich) 标记。使用 EVOS FL Auto 2 细胞成像系统（Thermo Fisher Scientific）对具有荧光蓝色细胞核的紫色活细胞进行可视化和成像。

H 2 O 2、NaOx、COM和尿液的选定浓度被认为是诱导衰老的亚致死浓度。我们的剂量依赖性实验表明，高于 25 µM H 2 O 2、900 µM NaOx、25 µg/cm 2 COM 和 10% (v/v) 尿液的浓度会显着降低细胞存活率，而低于这些浓度的浓度不能与未处理的对照相比，显着诱导细胞衰老。

SA-βgal染色

我们新鲜制备了 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β- d -galactopyranoside (X-gal; Vivantis) 在N , N-二甲基甲酰胺 (40 µL)、0.2 M 柠檬酸中的染色溶液– 磷酸钠缓冲液，pH 6 (1.74 mL)、200 mM 六氰基铁酸钾 (50 µL)、200 mM 亚铁氰化钾 (50 µL)、5 M NaCl (100 µL) 和 5 M MgCl 2 (5 µL)。细胞在 PBS 中用 2% (v/v) 甲醛和 0.2% (v/v) 戊二醛固定 5 分钟，然后用 PBS 洗涤两次。加入染色溶液，混合物在 37°C 下孵育 12-16 小时。用 PBS 洗涤染色的细胞并使用 EVOS FL Auto 2 细胞成像系统进行成像。表明衰老的 SA-βgal 阳性细胞被染成蓝色。

蛋白质羰基测量

使用含有蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Scientific）的放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液分离处理细胞中的蛋白质。使用二辛可宁酸 (BCA) 蛋白质测定试剂盒 (Pierce) 测定细胞裂解物样品中的蛋白质浓度。如前所述，使用 2,4-二硝基苯肼 (DNPH) 测定法测量蛋白质羰基含量（蛋白质氧化的指标） ( 32 , 33）。简而言之，将细胞裂解物与 10 mM DNPH (TCI America) 或 2 N HCl 在黑暗中孵育 1 小时，然后与三氯乙酸 (20%) 在冰上孵育 10 分钟。通过离心收集细胞沉淀，用乙酸乙酯:乙醇 (1:1) 洗涤，并用 6 M 盐酸胍 (Sigma-Aldrich) 溶解。在 375 nm 处测量吸光度 (A)。蛋白质羰基水平 (nmol/mg 蛋白质) 的计算公式为：((A DNPH – A HCl ) × 45.45)/蛋白质浓度。

总抗氧化能力测定

总抗氧化能力 (TAC) 使用 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS; Sigma-Aldrich) 测定。简而言之，制备并稀释 ABTS 自由基阳离子溶液 (Sigma-Aldrich)使吸光度 (734 nm) 达到 0.65 ± 0.02。将样品或维生素 C 标准品或蒸馏水（空白） (5 µL) 添加到 ABTS 自由基溶液 (295 µL) 中，并在 37°C 下避光孵育 10再次测量 734 nm 处的最小吸光度。抗氧化活性百分比 (%AA) 计算公式为：((A空白– A样品)/A空白) × 100。%AA 与维生素 C 浓度的标准曲线 (0 , 0.25, 0.5 和 1 mM)。样品的 TAC 由标准曲线计算得出，并报告为维生素 C 等效抗氧化能力。

SA-βgal 和 p16 的双重染色

如上所述，细胞在盖玻片上生长并染色 SA-βgal。随后进行了p16的免疫细胞荧光染色。将细胞与 10% Triton X-100 (Amreco) 一起孵育 3 分钟并用 PBS 洗涤。通过与 1% 正常马血清 (Gibco) 在 37°C 下孵育 1 小时来阻断非特异性结合。然后将细胞与抗 CDKN2A/p16INK4a 抗体 (Abcam, ab108349) (1:10,000) 在 4°C 下孵育过夜，然后与二抗 Alexa Fluor 488 结合山羊抗兔 IgG (1:10,000) (Cell Signaling) 孵育技术）在黑暗中在 37°C 下放置 30 分钟。使用 Fluoroshield 封固剂和 DAPI (Abcam, ab104139) 清洗和封固带有染色细胞的盖玻片。使用 EVOS FL Auto 2 细胞成像系统对 SA-βgal 和 p16 阳性细胞进行可视化和成像。

蛋白质印迹法检测 p16

我们准备了 5%（堆叠）和 12%（分离）聚丙烯酰胺凝胶，并将蛋白质样品（10 µg）加载到堆叠凝胶的孔中，然后在 100 V 下电泳 20 分钟，然后在 200 V 下 1 小时。将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，通过将膜与含有 5% 脱脂牛奶的 Tris 缓冲盐水和 Tween 20 孵育 1 小时来封闭非特异性结合位点。将含有转移蛋白的膜与抗 CDKN2A/p16INK4a 抗体 (Abcam, ab108349) (1:10,000) 或兔抗甘油醛 3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 单克隆抗体 (Cell Signaling Technology, 目录号 5174) 一起孵育。 4℃过夜。使用 ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific) 检测免疫复合物，并使用 ChemiDoc MP 成像系统 (Bio-Rad) 进行可视化。

相对端粒长度测量

根据制造商的说明，使用 GF-1 组织 DNA 提取试剂盒 (Vivantis) 从细胞中提取基因组 DNA。使用 NanoDropTM 2000/2000c 分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测量 DNA 浓度。在实时 qPCR 之前，DNA 样本储存在 –20°C。

相对端粒长度 (RTL) 由 qPCR 根据先前描述的程序确定 ( 34 , 35 )。RTL 的测量基于端粒重复的拷贝数与单拷贝基因（36B4，编码酸性核糖体磷蛋白）的拷贝数的比率。这种端粒与单拷贝基因 (T/S) 的比率与平均端粒长度成比例。使用的引物是：端粒：正向（F）5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3'，端粒：反向（R）5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3'，34B4：（F）5'-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3'，和36B4：（ R) 5'-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3'。PCR 在 95°C 下扩增 10 分钟，然后是 95°C 15 秒和 54°C 1 分钟的 40 个循环。

TRF1、TRF2 和 POT1 mRNA 表达

根据制造商的说明，使用 GF-1 总 RNA 提取试剂盒 (Vivantis) 从细胞中分离总 RNA。使用 TaqMan 逆转录试剂盒 (Thermo Scientific) 从 RNA 模板转换互补 DNA (cDNA)。对 TRF1、TRF2 和 POT1 进行了 qPCR（SYBR Master Mix，Biotechrabbit）。qPCR 条件为 95°C 10 分钟，然后是 95°C 15 秒和 60°C 20 秒的 40 个循环。引物（36）是TRF1：（F）5'-GCTGTTTGTATGGAAAATGGC-3'，（R）5'-CCGCTGCCTTCATTAGAAAG-3'，TRF2：（F）5'-GACCTTCCAGCAGAAGATGCT-3'，（R）5'-GTTGGAGGATTCCGTAGCTG -3'，POT1：(F) 5'-TCAGATGTTATCTGTCAATCAGAACCT-3'，(R) 5'-TGTTGACATCTTTCTACCTCGTATAATGA-3'，和 GAPDH：(F) 5'-AACGTGTCAGTGGTGGACCTG-3'，(R) 5'- AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT- 3'。

统计分析

数据表示为平均值±标准偏差 (SD)。使用非配对t检验确定两个条件之间的差异。GraphPad Prism 9.2.0 用于创建图表和进行统计计算。P < 0.05 的差异被认为是显着的。

结果

H 2 O 2、草酸盐、COM 和 KS 尿液诱导的 SIPS

用 H 2 O 2 (25 µM)、NaOx (900 µM) 或 COM (25 µg/cm 2 )处理后 SA-βgal 阳性 HK-2 细胞的比例显着高于未处理的对照组 (图 1A、B）。SA-βgal 阳性 HK-2 细胞的比例在用 KS 尿液 (10%, v/v) 处理后也显着高于用没有 KS 供体的尿液处理后的比例 (10%, v/v)。图 1B，插图）。用来自无结石供体的尿液处理后 SA-βgal 阳性 HK-2 细胞的比例与未经处理的对照培养物相当。图 1A、B）。用尿液处理后的 SA-βgal 染色显微照片显示在补充图 1中。

图1

H 2 O 2、草酸钠 (NaOx)、一水草酸钙 (COM) 或肾结石 (KS) 患者的尿液诱导过早衰老。(A)用 H 2 O 2 (25 µM)、NaOx (900 µM)、COM (25 µg/cm 2 )、KS 患者尿液 (10%, v/v) 和那些没有 KS (NS 尿液) (10%, v/v)。在用 H 2 O 2处理的 HK-2 细胞培养物中观察到更多的衰老细胞（蓝色箭头）、NaOx、COM 和 KS 患者的尿液（KS 尿液）与用无 KS 患者的尿液处理的培养物或未经处理的对照培养物相比。红色箭头表示添加 NaOx 后形成的 CaOx。(B)用 H 2 O 2、NaOx、COM 或来自 KS 患者的尿液处理的培养物中 SA-βgal 阳性细胞的比例显着高于未处理的培养物或用来自没有 KS 的供体的尿液处理的培养物。插图：用来自 KS 患者的单个尿液样本（KS 样本）与用来自没有 KS 的供体的单个样本（NS 样本）处理后 SA-βgal 阳性细胞的比例（％）。虚线和数字表示平均值。误差线表示至少三次处理的 SEM。（C）显示用所用浓度的 H 2 O 2、NaOx、COM和尿液处理的细胞活力测定没有显着改变细胞存活率。细胞核被 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 染色。* P < 0.05 对比对照，$ P < 0.05 对比 NS 尿液。放大 400 倍。

细胞毒性试验表明，用 H 2 O 2、NaOx、COM 和尿液在所用浓度下处理不会显着改变 HK-2 细胞的存活率。图 1C）。然而，与其他处理相比，用 NaOx 或 COM 处理往往会降低活细胞的比例。显示用不同浓度（2.5%–40%，v/v）尿液处理的 HK-2 细胞活力的代表性显微照片显示在补充图 2中。

H 2 O 2、草酸盐、COM 和 KS 尿液引起的氧化应激

用 H 2 O 2、NaOx、COM 或 KS 患者尿液处理的 HK-2 细胞的蛋白质羰基含量显着高于未处理的对照细胞或用无 KS 供体尿液处理的细胞。图 2A）。在每种情况下，用 KS 患者的尿液处理 HK-2 细胞的蛋白质羰基含量显着高于用没有 KS 供体的尿液处理。图 2A，插图）。未经处理的细胞和用来自没有KS的供体的尿液处理的细胞中的蛋白质羰基化水平没有显着差异。相比之下，用 H 2 O 2、NaOx、COM 或 KS 患者尿液处理的 HK-2 细胞中的 TAC 水平显着低于未处理的对照组。图 2B) 或在用来自没有 KS 的供体的尿液处理的细胞中，这没有显着差异。值得注意的是，用 KS 患者的尿液处理的 HK-2 细胞中的 TAC 水平（在所有情况下）都显着低于用没有 KS 供体的尿液处理的细胞中的 TAC 水平。图 2B，插图）。

图 2

用 H 2 O 2、草酸钠 (NaOx)、一水草酸钙 (COM) 或肾结石患者 (KS) 的尿液处理 HK-2 细胞诱导的氧化应激。(A)用 H 2 O 2、NaOx、COM 或 KS 患者的尿液（KS 尿液）处理后的蛋白质羰基化水平显着高于未治疗的对照组和用无 KS 患者的尿液（NS 尿液）处理后的蛋白质羰基化水平. 插图：用来自 KS 患者的单个尿液样本（KS 样本）与用来自没有 KS 的供体的单个样本（NS 样本）治疗后的蛋白质羰基水平进行比较。(B)用 H 2处理的 HK-2 细胞中的总氧化能力 (TAC) 水平KS 患者的O 2 、NaOx、COM 或尿液显着低于未经处理的细胞。用 NaOx、COM 和 KS 尿液处理后的 TAC 水平显着低于用 NS 尿液处理后。插图：用来自 KS 患者的单个尿液样本（KS 样本）与来自没有 KS 的供体的单个样本（NS 样本）进行治疗后的 TAC 水平。虚线和数字表示平均值。误差线表示至少三次处理的 SEM。* P < 0.05 对比对照，$ P < 0.05 对比 NS 尿液。

p16 在衰老细胞中上调

用 H 2 O 2、NaOx、COM 和 KS 患者的尿液处理 HK-2 细胞后，发现大量 SA-βgal 阳性细胞。在那些 SA-βgal 阳性细胞中 p16 染色强烈（图 3A）。显示用尿样处理后细胞中的双重染色的显微照片显示在补充图3中。在蛋白质印迹中检测到 p16 在 HK-2 细胞裂解物中的表达（ 图 3B、C）。虽然不像双染色实验中看到的那样明显，但在用 H 2 O 2、NaOx 和 KS 患者尿液处理的 HK-2 细胞中 p16 表达增加。KS 患者的尿液诱导的 p16 表达显着高于没有 KS 的供体和未经处理的对照细胞中的尿液。

图 3

用草酸钠 (NaOx)、一水草酸钙 (COM) 和 KS 患者的尿液（KS 尿液）处理诱导的衰老 HK-2 细胞中 p16 的上调。(A) SA-βgal 和 p16 免疫荧光的双重染色。p16 免疫反应在 SA-βgal 阳性细胞中呈强阳性。(B) Western印迹显示用来自KS患者的H 2 O 2 、草酸盐和尿液处理的HK-2中p16表达增加。数字表示由未经处理的对照标准化的 p16 与 GAPDH 的强度比。（C）相对 p16 表达，由 p16 与 GAPDH 的强度比表示，在条件之间进行比较。KS 尿液诱导的 p16 表达显着高于 NS 尿液和未处理的对照细胞。误差线表示 SEM。比例尺表示 50 µm。* P < 0.05 对比对照，$ P < 0.05 对比 NS 尿液。

来自没有 KS 的患者的合并尿液不会诱导 SA-βgal 阳性染色或上调 p16，但来自 KS 患者的具有高 iCOCI 的合并尿液会（补充图 4）。具有非常高 iCOCI 水平的混合尿液诱导细胞凋亡而不是衰老。

KS 患者的 H 2 O 2、草酸盐、COM 和尿液引起的端粒缩短

用 H 2 O 2、NaOx、COM 和 KS 患者尿液处理的 HK-2 细胞的 RTL 明显短于未处理的对照组（图 4）。与未经处理的对照相比，用来自没有 KS 的供体的尿液处理不会改变 RTL。来自 KS 患者的尿液使端粒长度减少了近一半，这些长度在未经治疗的对照组中发现。KS 患者的每个尿液样本都比没有 KS 的供体的尿液缩短了端粒（图 4，插图）。

图 4

用草酸钠 (NaOx)、一水草酸钙 (COM) 和 KS 患者的尿液 (KS 尿液) 处理的 HK-2 细胞的端粒长度缩短。与未经处理的对照细胞或用无 KS 供体的尿液（NS 尿液）处理的细胞相比，用 NaOx、COM 或 KS 尿液处理的 HK-2 细胞的相对端粒长度 (RTL) 显着降低。在所有情况下，KS 尿液将 RTL 降低到对照组的几乎一半，并且缩短的程度大于用 NS 尿液处理后的程度（插图）。虚线和数字表示平均值。误差线表示至少三次处理的 SEM。* P < 0.05 对比对照，$ P < 0.05 对比 NS 尿液。

KS 患者的尿液中 TRF1、TRF2 和 POT1 mRNA 的表达降低

H 2 O 2或KS患者尿液处理后HK-2中的TRF1 mRNA表达显着降低，但COM处理后高于无KS供体尿液或未处理对照细胞处理后的TRF1 mRNA表达。图 5A）。用 H 2 O 2、NaOx 或 KS 患者尿液处理的 HK-2 细胞中的 TRF2 mRNA 表达显着低于用没有 KS 供体的尿液处理的细胞或未处理的对照细胞中的 TRF2 mRNA 表达。图 5B）。用 H 2 O 2 、NaOx、COM 或 KS 患者尿液处理的 HK-2 细胞中 POT1 mRNA 表达显着低于用没有 KS 供体的尿液或未经处理的对照细胞处理的细胞中的 POT1 mRNA 表达。图 5C）。

图 5

暴露于成岩因子的 HK-2 细胞中 TRF1、TRF2 和 POT1 的转录本表达。(A)与未治疗的对照组或治疗后的对照组相比，用 H 2 O 2或 KS 患者的尿液（KS 尿）处理后细胞中的 TRF1 mRNA 表达显着降低，但用一水草酸钙 (COM) 处理后细胞中的 TRF1 mRNA 表达显着升高用来自没有 KS 的供体的尿液（NS 尿液）进行治疗。(B)用 H 2 O 2处理 HK-2 细胞与未经处理的对照细胞相比，NaOx 或 NaOx 显着降低了 TRF2 mRNA 表达，但与未经处理的对照细胞和用 NS 尿液处理的细胞相比，KS 尿液处理显着降低了 TRF2 mRNA 表达。(C)与未经处理的对照细胞或用NS尿液处理的细胞相比，用H 2 O 2 、NaOx、COM和KS尿液处理的HK-2细胞中的POT1 mRNA表达显着降低。插图显示了用来自 KS 患者的单个尿液样本（KS 样本）与用来自没有 KS 的供体的单个样本（NS 样本）治疗后 TRF1、TRF2 和 POT1 mRNA 的表达。虚线和数字表示平均值。误差线表示至少三次处理的 SEM。*P < 0.05 对比对照，$ P < 0.05 对比 NS 尿液。

讨论

我们试图确定过早衰老是否与 CaOx 岩石形成有关。在这里，我们展示了用草酸盐、CaOx 晶体或来自 CaOx KS 患者的尿液处理 HK-2 细胞可诱导氧化应激、上调 p16 表达、诱导 SIPS 和缩短端粒。衰老细胞可以通过产生和分泌 SASP 因子来增强炎症反应。因此，我们认为衰老可能是 CaOx 岩石形成过程中氧化应激和炎症之间新描述的机制联系。

草酸盐和 COM 诱导氧化应激 ( 8 )，氧化应激触发 SIPS ( 37 )，H 2 O 2通过 p16 上调诱导 SIPS ( 38 )。据我们所知，这是第一份显示 KS 患者的成石因子（包括草酸盐、COM 和尿液）可诱导 HK-2 细胞发生 SIPS，如 SA-βgal 活性增加和 p16 上调所示。值得注意的是，在衰老细胞中可以清楚地观察到 p16 的上调。这些发现表明，KS 患者的草酸盐、COM 和尿液诱导的 SIPS 是通过氧化应激和 p16 INK4a -pRB 通路的激活介导的。

我们强调 SIPS 仅在压力源的亚致死浓度下被诱导 ( 39 )。极高浓度的应激源会导致更高水平的氧化应激和凋亡性细胞死亡 ( 40 )。我们发现用浓度高于 25 µM H 2 O 2、900 µM NaOx 和 25 µg/cm 2处理 HK-2 细胞COM，诱导细胞凋亡而不是衰老。这种致死效应扩展到使用具有非常高 iCOCI 水平的合并尿液进行治疗，这会诱导细胞凋亡而不是衰老。氧化应激的程度很大程度上取决于 ROS 的水平。Sies 提出了“氧化应激”一词来表示有害地导致分子损伤和细胞死亡的高 ROS 水平，而另一个术语“氧化正常压力”表示在正常氧化还原信号传导中有益必需的较低 ROS 水平 ( 39 )。诱导衰老的 ROS 水平处于氧化 eustress 的较高水平。然而，Bienertova-Vasku 和 Scheringer 认为这两个术语（eustress 和advisory）相当相同，并建议仅用“stress”代替它们（41）。我们更愿意保留“氧化应激”。

在本研究中，我们发现用 H 2 O 2、NaOx、COM 或 KS 患者的尿液处理 HK-2 细胞会增加氧化应激并增加端粒缩短。启动衰老需要激活 p53-p21 CIP1或 p16 INK4a -pRB 轴中的信号级联反应 ( 27 )。在复制性衰老中，端粒自然缩短，衰老通过激活 DDR 和 p53-p21 CIP1通路发出信号。相比之下，SIPS 通过激活 p16 INK4a -p38 MAPK 途径显着发出信号，并且通常认为 SIPS 中端粒没有显着缩短（37）。然而，其他证据表明端粒缩短可以增加。氧化应激以增加端粒缩短为特征 ( 42 – 44 )。从本质上讲，端粒的 DNA 损伤是无法修复的，因为一个保护素复合物阻止了 DNA 修复蛋白的进入。当未修复的氧化性 DNA 损伤在端粒区域累积时，端粒丢失是不可避免的 ( 42 )。单链断裂是导致氧化应激下缩短的主要端粒 DNA 损伤 ( 45 )。ROS不仅攻击端粒DNA，还攻击整个基因组的非端粒DNA。端粒和非端粒 DNA 损伤都是在氧化应激下形成的，可以激活 DDR 和 p53-p21 CIP1导致过早衰老的途径 ( 46 )。虽然我们没有测量端粒 DNA 损伤，但有可能是成石因子诱导氧化性 DNA 损伤在端粒形成并积聚，从而增加了端粒缩短。在进一步研究中需要评估端粒 DNA 损伤和 DDR 激活。

当线性染色体或端粒的末端类似于可以激活 DDR 通路然后启动修复过程的双链断裂时，就会出现所谓的“末端保护问题”（47）。哺乳动物端粒使用shelterin来解决这个问题，通过形成一个大的套索结构端粒环（T-loop）来隐藏端粒末端并保护它们不被DDR组件识别。此外，shelterin 通过将端粒酶募集到端粒并驱动端粒酶合成能力来调节端粒酶活性（48）。庇护素复合物由六种蛋白质成分组成，包括 TRF1、TRF2、Rap1（与 TRF2 结合）、TIN2、TPP1 和 POT1。TRF1 和 TRF2 与双链端粒重复序列结合。TRF1 促进端粒复制，而 TRF2 促进 T 环形成。TRF1 和 TRF2 都有助于招募 TIN2、TPP1 和 POT1。相比之下，POT1 与单链 TTAGGG 重复 3'-突出端结合。氧化应激诱导的端粒缩短和 TRF1、TRF2 和 POT1 mRNA 的下调已在人肝细胞系 L-02 中得到证实 ( 36）。我们发现，在暴露于致石因子的 HK-2 细胞中，包括 TRF2 和 POT1 在内的庇护素 mRNA 被下调。POT1 mRNA水平降低最多。这意味着在成岩条件下，HK-2 细胞中庇护素复合物的形成受损。我们推测这可能导致对端粒末端的保护减少，并且它们更多地暴露于 DDR 系统，从而导致端粒缩短增加。

本研究是有限的，因为我们没有评估氧化端粒 DNA 损伤或 DDR (ATM/ATR) 或 p53-p21 CIP1通路的激活。我们没有测量 TRF1、TRF2 和 POT1 蛋白的表达，也没有测量端粒酶活性。在成岩条件下产生的衰老 HK-2 细胞是否可以产生和分泌 SASP 因子仍有待确定。除岩石因素外，尿液中存在的其他物质也可能导致过早衰老，但本研究并未对其进行研究。在这项研究中，没有广泛探索成岩物质诱导过早衰老的机制洞察力。

总之，草酸盐、CaOx 晶体和 CaOx 结石患者尿液引起的氧化应激上调了 p16 表达，增加了端粒缩短，并诱导 HK-2 肾小管细胞过早衰老。诱导 SIPS 似乎是通过细胞衰老信号通路、p16 INK4a -pRB 和端粒缩短-DDR-p53-p21 CIP1介导的。shelterin 成分的下调，尤其是 POT1，可能是导致 HK-2 细胞在成岩应激下端粒缩短增加的原因。我们的数据表明，由成岩环境诱导的过早衰老是一种新描述的细胞机制，可能至少部分有助于 CaOx 岩石形成。