前列腺癌文献：CRISPR 筛选有助于发现前列腺癌的新靶点

CRISPR 筛选有助于发现前列腺癌的新靶点

前列腺癌 (PCa) 是男性成人常见的恶性肿瘤之一。组学技术的最新进展，特别是在下一代测序方面，增加了识别与癌症疾病相关的基因的机会，包括 PCa。此外，基于 CRISPR/Cas9 技术的基因筛选阐明了癌症进展和耐药性的机制，这反过来又有助于发现新靶点作为新治疗靶点的潜在基因。在精准医疗时代，这些知识对于临床医生对患者治疗的决策至关重要。在这篇综述中，我们专注于迄今为止进行的 CRISPR 筛查 PCa 如何有助于鉴定生物学关键和临床相关的靶基因。 

关键词：前列腺癌，CRISPR筛选，CRISPR/Cas9

一、简介

前列腺癌 (PCa) 每年在全世界造成 160 万例病例和 366,000 例死亡 [  1  ]。在美国，PCa 是一种常见的癌症，也是男性癌症相关死亡的第二大原因 [  2  ]。雄激素是促进 PCa 细胞生长的关键因素，而雄激素剥夺疗法 (ADT) 是男性转移性 PCa 的主要治疗方法 [  3  ]。虽然最初有效，但接受 ADT 的转移性 PCa 患者最终会产生耐药性并进展为不可避免地致命的转移性去势抵抗性前列腺癌 (mCRPC) [  4 ]。在过去的十年中，延长 mCRPC 寿命的药物得到了扩展，包括第二代雄激素受体 (AR) 抑制剂、化疗药物紫杉烷卡巴他赛和用于 BRCA1/2 等 DNA 损伤修复蛋白缺陷的肿瘤的 PARP 抑制剂和ATM  。 然而，为 mCRPC 患者确定新的治疗靶点并为现有疗法提供新的遗传标记仍然是一项重大挑战。 使用成簇的规则间隔短回文重复序列/Cas9 (CRISPR/Cas9) 的基因组编辑技术的最新进展为进行基因筛选以全基因组方式研究生物系统提供了一种强大且公正的工具，这是理想的目标基因的鉴定。在 CRISPR/Cas9 之前，功能遗传筛选使用 RNA 干扰 (RNAi) 寡核苷酸研究功能丧失和 cDNA 过表达文库用于研究功能获得 [  13  ,  14  ,  15  ,  16 ]。然而，cDNA过表达文库的构建具有挑战性。

此外，与 RNAi 敲低分析的并排比较揭示了使用 CRISPR/Cas9 [  17  ] 进行功能基因组 KO 筛选的优势。因此，迄今为止已经进行了许多基于野生型 (WT) Cas9 的 CRISPR-KO 筛选。近年来，越来越多的研究还利用了催化死亡 Cas9 (dCas9) 的突变体，其中 WT Cas9 的核酸酶发生突变，使其失去功能 [  18  ,  19  ]。dCas9 已与一系列染色质修饰融合蛋白融合，将其转化为高度通用的酶，可用于执行 CRISPR 激活 (CRISPRa) 或抑制性 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 筛选 [  19 ,  20  ]。

在这篇综述中，将依次讨论不同类型筛选方法（包括方法学）的基本概念，然后进行迄今为止使用此类筛选策略来识别 PCa 中的靶基因的研究。在整个过程中，我们将讨论了解去势抵抗性前列腺癌 (CRPC) 的分子特征并通过基因组研究（例如 CRISPR 筛选）识别靶标在执行精准医疗和进行临床试验中的重要性。

2. CRISPR 筛选方法

示意图概述显示在 图1 .

图1 CRISPR屏幕的示意图。 sgRNA 文库被转导到感兴趣的细胞中，然后进行表型选择。 对于基于活力的筛选，受感染的细胞要么照常培养，要么经受选择性应激（通常是特定药物等）以实现表型。 对于标记选择，单元格按 FACS 排序。 随后进行选择，收获基因组 DNA，并通过 PCR 扩增编码的 sgRNA 并通过 NGS 鉴定。 候选命中由计算算法确定，计算算法提供分数作为每个 sgRNA 的值。 命中按其 sgRNA 的相对富集分数排序（例如，第 0 天与第 28 天，或未选择的对照与选择的样本）。 * 表示每一步对应的节号。

2.1文库

用于 KO 筛选的几个合并文库可从浏览源 Addgene 获得，例如 GeCKO、H1/H2、Brunello 和 TKO CRISPR - KO文库[ 21、22、23、24  ] 。这些文库包含超过 18,000 个基因，每个基因有 4-10 个单向导 RNA (sgRNA)。同样，用于激活筛选的 CRISPRa 和 SAM 文库以及用于抑制筛选的 CRISPRi 文库也是共享的[ 25、26、27 ]。自定义库对于感兴趣的特定研究很有用 [ 28 ]。

.2. 文库和转导的病毒包装

使用 CRISPR/Cas9 系统进行混合筛选的第一步是生成一个受 sgRNA 文库慢病毒感染的受干扰细胞文库。通过将 sgRNA 文库转染到适当的宿主细胞中来产生病毒，例如具有优异病毒生产能力的 HEK 293FT 细胞。为避免在宿主细胞占用多个 sgRNA 并针对每个细胞靶向多个基因的情况下产生混淆，通过经验确定病毒滴度来确保低 (~0.3) 感染复数 ( MOI ) [  27、29、30  ]。重要的是要注意这一步的局限性——一些模型，如 PCa 的 NCI-H660 和 VCAP 细胞，使得通过慢病毒方法实施工具变得非常具有挑战性。

2.3. 基于生存能力的筛选

最基本的实验之一是识别影响细胞适应性的基因。由于降低细胞适应度的扰动将在筛选结束时耗尽或完全不存在，因此这种类型的筛选被称为负选择筛选。负选择筛选最常用于癌症生物学领域，以识别由于特定突变、拷贝数改变、表达模式和其他目标引起的肿瘤细胞的依赖性 [  24  ,  31  ,  32  ,  33  ,  34 ]。最简单的负选择筛选形式之一是长时间连续培养细胞，以识别细胞生长所需的基因。这种筛选已被用于识别测试细胞系所需的必需基因和特定癌细胞系中基因依赖性的一小组基因 [  35  ,  36  ,  37  ]。另一种负选择筛选形式，在具有给定遗传背景的细胞系中进行，是识别合成致死相互作用的基础，其中两个基因的同时抑制会损害细胞活力 [  38 ]。合成相互作用的发现将使癌细胞的靶向治疗成为可能，使药物仅对具有特定改变的细胞起作用，并可以为癌症治疗提供一种新方法。 阴性选择筛选的替代方案是阳性选择筛选，它侧重于在一段时间内富集的细胞。这些筛选已用于识别对小分子 [ 14、17、39 ]  、 条件[ 40 ] 和 病原体感染， 产生 抗性的 扰动 ]。在正选择筛选中，大部分种群被淘汰，少数幸存的扰动可能会富集超过 100 倍。

最终，单个筛选可以导致阳性和阴性选择的表型。例如，癌细胞系的基于活力的 KO 筛选可以揭示癌基因的消耗和肿瘤抑制因子的富集。通常，中等剂量的小分子可以识别致敏基因和抗性基因[  46  ]。

2.4. 标记选择屏幕

标记选择筛选旨在识别影响特定报告分子表达的遗传元件，表型不是基于细胞活力，而是基于影响标记蛋白表达的突变。在这种类型的筛选中，可以通过用荧光标记替换感兴趣基因的编码序列来对报告基因进行基因工程。最终，荧光激活细胞分选 (FACS) 允许通过对具有影响标记表达的 sgRNA 靶向基因的细胞进行分选来识别上游表达调节因子 [  27  ,  47  ]。

2.5. 分析（算法）

在选择步骤之后，从存活的细胞或 FACS 选择的细胞中收集 DNA，并使用 PCR 从细胞群中分离基因组 DNA 并读取负责表型的基因。随后，使用下一代测序 (NGS) 进行大规模并行测序，以覆盖编码 sgRNA 的区域。现有的几种算法，例如基于模型的全基因组 CRISPR/Cas9 KO 分析 (MAGeCK) [  48  ,  49  ,  50  ], edgeR [  51  ], 基因本质的贝叶斯分析 (BAGEL) [  52  ], CRISPR AnalyzeR for Pooled Screens (caRpools) [  53  ]，使用 Python (PinAPL-Py) [  54  ] 和 DrugZ [ [ 55  ] 然后可用于通过检查对照和表型样品之间 sgRNA 丰度的差异来确定负责观察到的表型的候选基因。

2.6. 验证

筛选分析提供了导致表型的候选基因的排序列表。为了评估哪些基因对表型有贡献以及有多少，验证是必不可少的。最关键的验证方法是通过引入靶向感兴趣基因的 sgRNA 来评估所选表型是否确实可重现。近期对 sgRNA 特异性的改进减轻了确认与靶标结合的需要，只要针对同一遗传元件的多个 sgRNA 引发表型。

但是，如果需要，可以进行基因组 PCR、RT-qPCR 和蛋白质印迹等分析来评估目标基因的功能修饰 [  25  ,  27 ]。重要的是要注意，对目标活动的确认并不排除由于脱靶效应而产生表型的可能性。因此，不仅使用具有最高靶向活性的一个 sgRNA 还使用每个基因的多个 sgRNA 对表型进行连续验证实验是至关重要的。拯救实验是另一种确认遗传实体是否赋予表型的方法。目标是确认在 CRISPR/Cas9 编辑的细胞中将候选表达恢复到生理水平是否会使细胞恢复到它们的野生型状态 。

3. PCa 中的 CRISPR 筛选

迄今为止，已在 PCa 中报告了几种 CRISPR 筛选。本节将介绍每种屏幕类型的分类结果（ 表格1 ）。

3.1 发现潜在目标

第一个 CRISPR-KO 筛选于 2014 年初连续发表 [  17  ]。然后，Fei 等人。报道了 2017 年关于 PCa 细胞中全基因组 CRISPR-KO 筛选的第一篇论文 [  57  ]。他们在 LNCaP 细胞中使用 GeCKO v2 文库进行了基于活力的筛选，并使用他们定制开发的 MAGeCK 和 MAGeCK-VISPR 算法将 HNRLP 鉴定为 PCa 生长所需的必需基因 [  48  ,  49 ]。HNRNPL 通过线性选择性剪接或反向剪接 circRNA 形成直接调节其 RNA 靶标，包括 AR 编码靶标。重要的是，HNRNPL 及其 RNA 靶标都在 PCa 中异常表达，支持它们的临床相关性。他们得出结论，HNRLP 是 PCa 的潜在治疗靶点。同样，使用核蛋白 sgRNA 子库库的 CRISPR-KO 筛选揭示了 17p 的杂合缺失，这在转移性 PCa 队列中经常检测到（高达 63%），它赋予了对 RBX1 的选择性依赖 [  58 ]。RNAP2和RBX1的同时抑制以协同方式抑制CRPC的生长，这增强了RNAP2抑制剂α-鹅膏菌素偶联的抗EpCAM抗体的治疗效果。Aquirre 等人。在包括 PCa 在内的 33 种癌细胞系中进行了基因组规模的功能丧失遗传筛查 [  59  ]。吉山等人。随后分析他们在 PCa 细胞系中的屏幕数据，这些数据是从 CRISPR-KO 屏幕 [  60  ]、癌症依赖图 (DepMaP) [  61 ] 的公共资源获得的 ]。他们将组蛋白去甲基化酶 JMJD1C (KDM3C) 确定为 AR 阴性的特定于上下文的漏洞。在几个 PCa 模型中，他们证明 JMJD1C 消耗通过激活肿瘤坏死因子 α (TNFα) 网络导致 AR 阴性细胞的特异性生长抑制。最后，他们得出结论，将 JMJD1C 抑制鉴定为 AR 阴性 PCa 的特定脆弱性，可能为接受 AR 抑制剂治疗的 PCa 患者提供替代药物靶点。 

达斯等人。在转移性 PCa 模型中进行了第一次基因组规模的 CRISPRi 筛选，以确定细胞存活所需的基因 [  62  ]。他们证明，驱动蛋白家族成员 4A (KIF4A) 和 WD 重复域 62 (WDR62) 在体外和体内促进侵袭性 PCa 表型，从而将 KIF4A 和 WDR62 提名为 PCa 驱动基因，并结合其临床数据。 标记选择筛选，一种基于 CRISPR 的 E3 连接酶筛选方法在 DsRed/EGFP-PDK1 报告基因 HKT 细胞中由 Jian 等人进行。发现 Cullin3SPOP E3 连接酶促进 PDK1 泛素化和随后的降解 [  63  ]。值得注意的是，大约 15% 的 SPOP 突变已在 PCa环境中发现[  64、65、66 ]。他们使用 PCa 细胞系进行了研究，其中 SPOP 以 CK1/GSK3β 介导的磷酸化和 degron 依赖性方式识别 PDK1。无论是 SPOP 的功能缺失突变还是其结合区 PDK1 的功能获得突变都减弱了 SPOP 对 PDK1 的识别和泛素化，导致 PDK1 蛋白丰度、AKT 激酶活性升高和肿瘤恶性肿瘤的益处，表明PDK1-AKT 通路将成为突变的 SPOP 或 PDK1 驱动的 PCa 的潜在靶标。

3.2. 发现药物诱导的合成杀伤力靶点和耐药机制

ADT 用于治疗局部晚期和转移性 PCa，在大多数患者中实现缓解。 尽管 ADT 在大多数患者中提供了持续 1-2 年的几乎确定的缓解，但随着 CRPC [ 5  ]的出现，癌细胞变得耐药。AR 信号传导在 CRPC 中起着关键作用，正如阿比特龙和恩杂鲁胺等 AR 诱导药物的有效性所证明的那样。不幸的是，患者对这些药物产生耐药性并总是死于这种疾病 [  74  ,  75  ,  76  ]。 通过全基因组 CRISPR/Cas9 筛选，Palit 等人。鉴定了分裂 3 (TLE3) 的转导素样增强剂作为 AR 抑制剂敏感性的调节剂，一旦丢失，就会赋予 PCa LNCaP 细胞对恩杂鲁胺的抗性 [  67 ]。有趣的是，与 TLE3 和 AR 在 GR 基因座的结合一致，TLE3 缺失导致糖皮质激素受体 (GR) 表达上调。他们的结果为在 PCa 细胞中 AR 抑制背景下 GR 基因座的调节提供了新的见解，表明 TLE3 是 GR 介导的 AR 抑制剂抗性的调节剂。使用类似的方法，该小组随后着手鉴定其抑制作用可以增强恩杂鲁胺在 PCa 细胞中的功效的激酶，目的是发现与耐药性相关的基因和能够克服恩杂鲁胺耐药性的潜在药物组合 [  68 ]。他们发现，抑制 BRAF 或下游 MAPK 成分 MEK 和 ERK，增强了 BRAF 基因激活激酶结构域突变的 PCa 细胞对恩杂鲁胺的敏感性。这些发现表明在 BRAF 突变的 PCa 中共同抑制 MAPK 和 AR 通路的治疗潜力。 

雷等人。进行了激酶组规模的 CRISPR/Cas9 筛选，并确定细胞周期蛋白依赖性激酶 12 (CDK12) 对 PCa 细胞活力至关重要 [  69  ]。CDK12抑制剂THZ531具有显着的抗肿瘤作用。从机制上讲，THZ531 下调 AR 信号并优先抑制 CDK12 抑制敏感转录本 (CDK12-ISTs)。此外，他们发现 THZ531 与多种 AR 拮抗剂显示出显着的协同作用。 利用临床合成致死率靶向 DDR 通路的药物已经在几种类型的癌症中表现出治疗益处 [  77  ,  78  ]。奥拉帕尼还显示出对 DDR 缺陷患者转移性 PCa 的益处，将潜在的反应生物标志物扩展到 BRCA [  9  ,  10  ]。其他旨在抑制 DDR 的分子和药物组合，如 ATR、ATM、CHK1 和 DNA-PK，也得到了很好的研究 [  79  ,  80  ,  81  ,  82  ,  83 ]。齐默尔曼等人。在广泛的三种不同细胞系（Hela、RPE-hTERT 和 SUM149PT）中使用 PARP 抑制剂奥拉帕尼治疗进行了 CRISPR-KO 筛选，并呈现了一组高可信度的 73 个基因，这些基因在发生突变时会导致对 PARP 抑制剂的敏感性增加 [  70  ]。最后，他们发现核糖核酸酶 H2 (RNASEH2) 的缺失使细胞对 PARP 抑制敏感，从而阻碍缺乏核糖核酸酶 H2 的细胞中的核糖核苷酸切除修复，导致 PARP 捕获损伤，损害 DNA 复制并损害基因组完整性。值得注意的是，RNASEH2 还通过另一个 CRISPR-KO 筛选确定了导致 ATR 抑制剂合成致死性的缺失 [  71 ]。

在几种类型的癌细胞系（293A、HCT116 和 MCF10A）中使用 ATR 抑制剂进行的全基因组 KO 筛选表明，RNASEH2 缺乏在体外和体内均会诱导 ATR 抑制剂敏感性。尽管这两项研究都在非 PCa 癌细胞系中进行了 CRISPR 筛选，但他们证明了 RNASEHEB 的丢失，这在 PCa 队列中特别常见（高达 20% 或更多），通过 PARP 或 ATR 抑制导致合成致死率，表明RNASEH2B 状态是两种药物治疗 PCa 患者的潜在决定因素。 二甲双胍是一种口服双胍类药物，作为 2 型糖尿病的一线治疗药物，因其对包括 PCa 在内的多种实体瘤的抗增殖和抗癌作用而备受关注[  84  ,  85  ]。然而，关于二甲双胍的使用与发生 PCa 的风险和生存率之间的关联，已经报道了相互矛盾的结果 [  86 ]。目前，正在研究二甲双胍联合靶向雄激素受体轴的药物对 CRPC 患者和 RP 后接受补救性放疗的患者的额外作用。总体而言，二甲双胍利用与 PCa 之间的关系仍存在争议。陈等人。通过使用 SAM 库进行全基因组 CRISPR/Cas9 激活筛选，为确认 DU145 细胞中二甲双胍耐药的遗传决定因素提供了新的证据 [  72  ]。结果表明，ECE1、ABCA12、BPY2、EEF1A1、RAD9A 和 NIPSNAP1 有助于 PCa 细胞对二甲双胍的耐药性。他们进一步证明，RAD9A 可能通过上调调节性 T 细胞参与二甲双胍的肿瘤免疫微环境 (TIME) 调节。 聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶 (ADI) ADI-PEG20 已在包括 PCa 在内的至少 20 项 I/II 期临床试验中进行了研究，并已证明具有出色的安全性 [  87  ,  88  ,  89  ]。最近的试验表明，与其他药物联合使用可治疗多种癌症 [  90  ,  91  ,  92  ]。

为了确定赋予治疗抗性的新因素，Chu 等人。在用 ADI 处理的 ADI 抗性 M231 细胞中进行了全基因组 CRISPR-KO 筛选，并通过激活 AKT/mTOR/STAT3/CCL2 途径，结合 RNA-seq 分析确定 TREM-CCL2 途径是抗性的关键因素[  73 ]。他们还在 PC3 PCa 细胞模型中进一步验证了结果。本研究揭示了 ADI 耐药的新途径，并为克服乳腺癌和 PCa 中的 ADI 耐药提供了新的靶点。

4.结论

基因组测序的最新进展为 CRPC 的分子研究提供了新的见解。DNA 修复缺陷的检测，例如 BRCA2 的突变，可以指导选择接受铂化疗 ] 或聚（ADP-核糖）聚合酶 (PARP) 抑制剂 [  9  ] 治疗的患者，而据报道，错配修复基因和微卫星不稳定性是检查点抑制剂免疫治疗敏感性的调节剂 。预后不良的特征，例如存在 RB1 缺失 ，可能会指导未来的治疗策略。 全基因组 CRISPR/Cas9 筛选为询问此类基因提供了一种稳健且公正的方法，自 2014 年推出以来，一系列具有里程碑意义的报告表明，该技术产生了高质量的功能命中 [  12 ]。该技术与其他正交方法（例如质谱法）相结合，在系统规模上研究蛋白质功能，可以提供有价值的功能见解，而使用传统方法需要数年时间才能建立起来。

这篇综述最终展示了迄今为止关于 PCa 的几个筛选结果。由于该领域有一些特定的障碍，包括细胞系数量有限，因此必须仔细了解与临床相关性的筛查结果以推断临床环境。即使考虑到这一点，这里介绍的研究也有可能具有临床重要性。值得注意的是，其他癌细胞系中的一些 CRISPR 筛选也为 PCa 提供了新的靶标 [  63  ,  70  ,  71 ]，这表明在任何类型的癌细胞中监测筛查结果的重要性，这可能会导致发现用于 CRPC 治疗的生物标志物。在这方面，DepMap 等数据门户提供了帮助，因为已经在包括 PCa 在内的数百个细胞系中以多癌症谱系方式实施了 CRISPR 筛选。如上所述，他们对其他肿瘤的数据分析可能对 PCa 有用，反之亦然。

关于本文介绍的筛选中的新目标，有必要在不久的将来对 PCa 患者进行进一步研究。 我们通过基因组研究（例如 CRISPR 筛选）对 CRPC 分子特征的了解将以增加分子测试的形式应用于临床，以增加药物使用和临床试验资格。因此，CRPC 患者将越来越多地受益于我们对基因组改变在 PCa 病因学中的作用以及治疗具有特定突变的患者的潜力的理解。