在LTBI人群中鉴别活动性肺结核的生物标志物

  近日，Microbiol Spectr杂志发表了一项初步研究，旨在探索DNA甲基化与结核潜伏感染（LTBI）人群活动性肺结核发生的关联研究（Du Y, Gao X, Yan J, et al. Relationship between DNA Methylation Profiles and Active Tuberculosis Development from Latent Infection: a Pilot Study in Nested Case-Control Design. Microbiol Spectr,  2022 Apr 21:e0058622. doi: 10.1128/spectrum.00586-22）。该研究主要由中国医学科学院病原生物学研究所完成，研究采用巢式病例对照设计，回顾性检测LTBI人群中发展为活动性肺结核者与未发病者DNA甲基化程度，探索DNA甲基化与LTBI人群发生活动性肺结核的关系，为寻找LTBI与活动性肺结核的鉴别诊断生物标志物提供新的思路。中国医学科学院病原生物学研究所的博士生杜莹为文章第一作者，高磊研究员与辛赫男副研究员为文章的通讯作者。

研究背景

  针对LTBI高危人群开展预防性治疗是直接降低发病率，实现2035年“END TB”全球战略目标的重要手段。目前，肺结核的诊断仍然是以病原学（包括细菌学、分子生物学）检测为主，存在敏感性低、周期长、易受痰标本质量影响等问题。探索基于宿主血液的生物标志物用于诊断活动性肺结核一直是领域内的研究热点。不仅为LTBI与活动性肺结核的鉴别诊断提供新的思路，也是LTBI人群中活动性肺结核的早期诊断及后续开展预防性治疗、实现精准干预的前提。既往研究发现，结核分枝杆菌（MTB）可以通过激活或抑制参与免疫反应的关键免疫基因来改变宿主表观基因组从而调节转录机制。表观遗传学在宿主、MTB和环境之间都发挥调控作用，在鉴别诊断结核病方面具有巨大的潜力。DNA甲基化是目前研究最广泛的表观遗传方式，本研究以此为切入点，探索DNA甲基化与活动性肺结核发生的关系。

研究方法

1、研究设计及参与者：该研究依托于2015年开展的一项探索结核潜伏感染预防性治疗方案的随机对照试验，针对其中未进行预防性治疗的调查对象进行了连续5年的随访，分别收集基线及随访时的自身前后两份外周血样本进行分子标识研究。基线时共1155例未进行预防性治疗的结核潜伏感染者参与了该研究，通过5年随访，共有26例研究对象发展为活动性肺结核，从中选择有足够外周血单核细胞的15例调查对象作为病例组，并根据年龄、性别匹配了15例未发生活动性肺结核的调查对象作为对照组。

2、Infinium Methylation EPIC BeadChip 850K实验：收集每例调查对象的基线及随访时自身前后各3 ml血液样本并分离外周血单核细胞，使用Puregene Core试剂盒提取基因组DNA，使用EZ-96DNA甲基化GOLDTM试剂盒对基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化。使用Infinium Methylation EPIC BeadChip（简称850K芯片）完成基因组DNA甲基化水平的检测（由上海伯豪生物提供服务）。850K芯片甲基化原始数据首先采用R软件minfi包进行预处理，然后使用R软件IMA包计算组间的差异甲基化位点。采用Beta值（β）作为衡量该位点甲基化程度的指标。β值区间为（0，1），满足｜△β｜>0.1，P<0.05条件的位点为显著差异的甲基化位点。

研究结果

1、调查对象基本信息：对30例研究对象的自身前后两份样本共60份样本进行了850K芯片筛选，其中包括15例结核病患者（11例病原学确诊病例及4例临床确诊病例）和15例年龄、性别匹配的结核潜伏感染对照组。30例调查对象的年龄中位数为65（62，68）岁，以男性居多（73.33%，22/30）。两组的IFN-γ释放水平、吸烟和饮酒间差异无统计学意义，其中，病例组的BMI低于对照组（P=0.025），但均在正常范围内。

2、甲基化芯片筛选结果：850K芯片对每例参与者的自身前后两份样本进行检测并评估全基因组DNA甲基化程度。共分析了60份血液样本中863159个CpG位点的甲基化状态。在研究终点，病例组和对照组之间共有2826个差异甲基化位点，在病例组自身前后，共有78110个差异甲基化位点。对照组自身前后没有差异的甲基化位点共有34830个，为了达到在结核潜伏感染人群中鉴别诊断活动性肺结核的目的，我们选择研究终点时病例组和对照组之间的差异甲基化位点，并且同时满足病例组自身前后甲基化程度发生改变，对照组自身前后甲基化差异没有统计学意义，共得到134个甲基化位点作为候选分子标识。

为了进一步分析随访期间病例组和对照组之间的2826个dmCpGs的生物学功能，采用DAVID进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。通过GO功能分析，结果表明，dmCpGs主要富集于胰岛素分泌的生物过程中，涉及对葡萄糖刺激的细胞反应、涉及吞噬作用的Fc-γ受体信号传导途径和钙离子螯合的调节。KEGG分类结果表明，这些dmCpGs主要富集在细菌感染性疾病和癌症中。

在这134个差异甲基化位点中，选择位于转录起始位置200bp或者1500bp、SNP_distance > 10、并且单核苷酸多态性发生率低的位点，共得到8个候选甲基化位点进行进一步分析，其中6个位点为高甲基化状态（cg02493602、cg02206980、cg02214623、cg12159502、cg14593639和cg25764570），2个位点为低甲基化状态（cg02781074和cg12321798）。

3、差异甲基化的诊断效能：8个dmCpGs的AUC在0.72 ~ 0.84之间。其中，位于SIRT1基因CPG岛启动子区的cg12159502位点呈现最佳AUC，为0.84 (95%CI: 0.6～0.95)，敏感度为73.33% (95%CI: 48.05%～89.10%)，特异度为86.67% (95%CI: 62.12%～97.63%)。按照WHO的TPP准则，对于给定的93.33%的敏感度，cg14593639的特异度最高，为66.67% (95%CI: 41.71%～84.82%)。

随后，我们计算了8个dmCPGs不同组合的诊断效能。共有247个不同的组合（任意两个CpG的28个组合，任意三个CpG的56个组合，任意四个CpG的70个组合，任意五个CpG的56个组合，任意六个CpG的28个组合，任意七个CpG的8个组合，所有位点组合的1个组合），有52个组合的诊断效能符合世界卫生组织TPP基准。其中，“SIRT1+SIRT5+GNB2L1+FLJ44635”组合表现最佳，敏感度为93.33%，特异度为86.67%。

研究结论

  初步结果提示，SIRT1等基因CPG岛启动子区DNA高甲基化可能作为在LTBI人群中鉴别活动性肺结核的生物标志物，在LTBI高危人群中进行系统筛查不仅可以实现早期发现病人，还可以快速的鉴别出活动性肺结核患者并尽早对其开展预防性治疗。考虑到亚临床结核和病原学阴性的肺结核患者，与基于痰液样本的检测方法相比，基于血液的生物标志物可大大提高诊断敏感性及时效性。鉴于纳入研究样本量有限，本研究结果尚需在大样本的独立人群中进一步验证。